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沙门氏菌病(Salmonellosis)是由沙门氏菌引起的常见人畜共患病,除了初生动物,一般人畜感染后呈现无症状的带菌状态,长期排菌,造成养禽业严重的经济损失。其中肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Enteritidis,S.enteritidis)是引起沙门氏菌病和食物中毒的主要原因之一。日常生产中预防和控制肠炎沙门氏菌的主要方法是抗生素治疗,但是由于抗生素的不合理使用,所产生的耐药性问题和药物残留问题越来越受到关注。因此,寻找一个安全有效的途径来防治肠炎沙门氏菌是亟需解决的问题。经过不断地探索发现,采用疫苗免疫结合合理用药的方式是防治肠炎沙门氏菌感染较为有效的方法。因此,开发出具有强保护力的广谱的新型基因工程苗有着重要的意义。本研究通过使用以asd基因为营养缺陷标志基因的减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R染色体-质粒平衡致死系统,表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛抗原,并评价该重组口服疫苗对肠炎沙门氏菌病的免疫保护效果。1.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的克隆与表达SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌及其相近的D-群沙门氏菌血清型中,在体外克隆和表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子sef结构基因,并检测重组菌毛的生物学活性。以表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子的肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA为模板,利用分步PCR扩增出编码SEF14菌毛操纵子的基因序列,将其克隆至表达载体pBR322,构建和筛选出含sef完整基因并正确插入pBR322的重组质粒pBR322-sef。再将此重组质粒转化至不含任何菌毛和鞭毛的大肠杆菌SE5000工程菌,并命名为psef。将pBR322空载体质粒转化至SE5000,构建阴性对照菌,命名为p322。结果发现,重组菌psef能与SEF14菌毛单克隆抗体发生明显的凝集反应,而不与p322发生任何可见的凝集反应。电镜下可以观察到重组菌psef菌体表面表达了菌毛,Western blot可得到分子量大约为14.3kDa的蛋白条带,表明SEF14菌毛已成功在SE5000表达。本研究为进一步研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛生物学作用及开发出以SEF14菌毛作为免疫原的基因工程苗奠定了基础。2.肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要亚单位sefA的克隆、原核表达与多克隆抗体的制备根据Genbank发表的肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子主要结构亚单位sefA基因序列设计一对引物,以肠炎沙门氏菌标准株SD-2基因组DNA作为模板,PCR扩增sfA基因片段,将PCR产物按预定的阅读框插入原核表达载体pET-28a(+),构建出重组质粒pET-28a(+)-efA,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)进行高效诱导表达,得到大小约为14kDa的可溶性重组蛋白。经过条件摸索,重组菌在IPTG浓度为0.2mM的条件下,25℃诱导5h时蛋白表达量最高。通过Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,获得高特异性的SEFA多抗血清,该多抗血清能识别肠炎沙门氏菌及重组原核表达载体。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白rSEFA,并成功获得鼠源SEFA多抗血清,为进一步探究构建能表达SEF14菌毛抗原的重组基因工程疫苗奠定基础。3.表达肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的重组减毒鸡伤寒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究基于研究一构建的具sef操纵子基因并能表达SEF14菌毛的psef重组质粒,使用SalI和NcoI双酶切将其插入含asd基因的表达载体pYA3342中,再转化至减毒鸡伤寒沙门氏菌SG9R△asd突变株中,构建出重组菌SG9R(pYA3342-sef);利用PCR技术扩增出编码表达SEF14菌毛的sefA主要结构亚单位基因,以同样的方法构建出重组菌SG9R(pYA3342-sefA)。采用玻板凝集试验和Western blot验证重组菌菌毛的表达,并进行鸡巨噬细胞系HD11的吞噬试验和存活试验,分析两组重组菌的生长特性、遗传稳定性及口服安全性等生物学特性。细胞试验表明,HD11对SG9R(pYA3342-sef)组吞噬数量少于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,该组菌在HD11中的存活能力也低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组,且差异均显著(P<0.05)。将35日龄非免疫清远麻鸡口服接种重组菌,并在二周后进行二免,其中SG9R(pYA3342-sef)、SG9R(pYA3342-sefA)为免疫组,SG9R(pYA3342)为空载体对照组,另设PBS空白对照组。免疫后每组每周随机取3只鸡分离外周血淋巴细胞,通过流式细胞术分析外周血CD3+CD8+T淋巴细胞动态变化。结果表明,SG9R(pYA3342-sef)组CD3+、CD8+ T细胞各时期含量均高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组,且在二免两周达到最高;分别采集各组鸡每周的血清,利用间接ELISA检测其体内特异性IgG抗体的水平,结果显示二免一周和二免两周时SG9R(pYA3342-sef)组血清IgG抗体水平显著高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);二免两周后收集气管黏膜样品和肠黏膜样品,利用间接ELISA检测特异性sIgA的水平,SG9R(pYA3342-sef)组十二指肠、空肠、盲肠和回肠sIgA抗体水平显著高于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组(P<0.05);在二免两周后对每组鸡口服攻毒肠炎沙门氏菌标准株SD-2,观察发现虽然每组鸡均未死亡,但但攻毒后一周每组随机剖检5只鸡,SG9R(pYA3342-sef)组病变显著低于SG9R(pYA3342-sefA)组和SG9R(pYA3342)组和PBS对照组。总结试验结果表明,重组疫苗菌株SG9R(pYA3342-sef)对肠炎沙门氏菌具有较好的免疫保护作用。