论文部分内容阅读
背景卵巢过度刺激综合征（OHSS）是一种卵巢刺激导致的严重的、潜在致死性的临床综合征。该疾病临床表现多样,主要以卵巢显著增大、雌二醇（E2）水平升高、血管通透性增加导致的富含蛋白的液体停留在血管外的间隙中,严重者可出现腹水、胸水及心包积液、血栓栓塞及多器官功能衰竭,甚至最终导致死亡。由于OHSS的复杂性,发病机制尚未完全清晰,目前的研究显示,OHSS的核心在于血管通透性的升高,而血管内皮细胞生长因子（VEGF）是公认的OHSS及血管通透性的重要调节因子。VEGF与其受体VEGFR2结合后可以通过打开相邻内皮细胞连接等方式使血管通透性升高。血清雌激素水平升高是OHSS发生的另一个高危因素,此外,在IVF周期中hCG日血清雌二醇水平是OHSS的重要预测指标。锌指转录因子ZNF217是一个定位于20q13.2的潜在的癌基因,与乳腺癌、卵巢癌及宫颈癌的侵袭和迁移密切相关。全基因组关联分析（GWAS）显示ZNF217是多囊卵巢综合征（PCOS）的致病基因,而PCOS是育龄期女性最常见的内分泌疾病,PCOS患者由于其卵巢储备功能较好,对促排卵药物反应性高,是OHSS发生的高危因素,因此PCOS的发病与OHSS存在相关性。PCOS的发病机制至今仍在研究中,目前的研究证明,PCOS是一种由遗传因素与环境因素共同导致的疾病,而ZNF217与PCOS的发病相关,因此可能参与OHSS的发生发展。尽管辅助生殖（ART）治疗过程中OHSS发病率较高,严重时甚至会危及生命,但是由于其病理机制较为复杂,目前的治疗一般以预防和对症治疗为主。Kisspeptin是一类由KISS1基因编码的多肽,其特异性受体为G蛋白偶联受体GPR54（KISS1R）,分布于人体的心脏,肝脏,胰腺等多个部位。Kisspeptin/KISS1R系统可抑制多种组织及器官中VEGF的表达而VEGF是诱导OHSS发生的重要因素,因此,Kisspeptin/KISS1R系统对OHSS的发生发展可能存在抑制作用。目的（1）探索ZNF217对OHSS发生发展的影响,着重于ZNF217对血管通透性与雌激素合成的影响。（2）探索Kisspeptin/KISS1R系统对OHSS是否存在预防及治疗作用及其具体机制。方法（1）构建OHSS大鼠模型并收集OHSS患者颗粒细胞和卵泡液,检测ZNF217在OHSS大鼠及OHSS患者体内的表达变化,探索ZNF217与OHSS的相关性。然后应用人卵巢颗粒细胞癌细胞系KGN,通过敲除和过表达ZNF217,进一步应用实时定量PCR、Western blot和ELISA等方法研究ZNF217与雌激素合成的关系及其具体的机制。最后应用人脐静脉内皮细胞细胞系（HUVEC）,通过敲除和过表达ZNF217,检测下游VEGF、TSP-1、NO及VE-cadherin的表达,研究ZNF217与血管通透性的关系及其具体机制,最终通过雌激素和血管通透性两方面探索ZNF217促进OHSS发生发展的具体机制。（2）构建OHSS大鼠模型,体外注射Kisspeptin-10（Kp-10）蛋白,观察腹腔血管通透性、卵巢大小、卵巢质量及血清雌激素水平等OHSS的主要临床表现的改变,然后应用HUVEC细胞系研究Kp-10抑制OHSS发生发展的具体分子机制。结果（1）ZNF217在卵巢分布广泛,不同时期的卵母细胞及颗粒细胞中均有表达,且颗粒细胞细胞核中表达量较高,而颗粒细胞是雌激素合成的主要细胞。OHSS大鼠模型及OHSS患者均出现血清雌激素水平升高及卵巢ZNF217表达升高,表明ZNF217与OHSS的雌激素合成相关。体外实验表明在颗粒细胞中,ZNF217通过正性调节环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB1）及芳香化酶（CYP19A1）,正性调控雌激素合成,促进OHSS的发生。（2）除了参与雌激素合成,ZNF217可能影响血管通透性,OHSS大鼠模型及OHSS患者均出现卵巢及卵泡液中血小板反应蛋白1（TSP-1）表达降低,而TSP-1是VEGF通路的抑制剂,此现象提示TSP-1与血管通透性相关。体外实验表明,TSP-1通过与其受体CD36结合正性调节咬合蛋白1（Claudin1）,同时可以通过与CD47结合负性调节NO合成,最终负性调节血管通透性。而ZNF217负性调控TSP-1,从而实现对血管通透性的正性调节。（3）OHSS大鼠出现血管通透性的升高,同时伴有卵巢组织及肺脏组织VEGF表达升高及Kp受体Kiss1r的表达降低,说明Kp/Kiss1r系统可能与VEGF的表达及OHSS相关。而外源性注射Kp-10可以抑制血管通透性及VEGF的升高,恢复OHSS大鼠卵巢及肺脏组织Kiss1r的水平。此外,OHSS患者出现卵巢颗粒细胞KISS1R表达降低,与OHSS大鼠一致,说明KISS1R的降低与OHSS发生发展相关,而外源性添加Kp-10对OHSS的症状有一定的抑制作用。（4）通过体外HUVEC研究,本课题组发现雌激素可以通过与ERβ结合从而抑制KISS1R的表达,同时促进VEGF及NO的合成,促进血管通透性的升高。而外源性添加Kp-10可以通过激活KISS1R,从而抑制雌激素对VEGF的促进作用,最终改善OHSS的血管通透性升高的症状。结论（1）PCOS的易感基因ZNF217通过正性调控雌激素的合成及血管通透性,参与OHSS的发生发展。（2）高水平雌激素可以抑制KISS1R的表达,从而促进VEGF及血管通透性的升高。（3）外源性注射Kp-10可以激活KISS1R,从而抑制高雌引起的VEGF的升高,改善OHSS的症状。