论文部分内容阅读
心血管疾病近几年成为中国居民的死亡原因之首,而血栓的形成是心血管疾病发生发展的重要原因,因此,通过抗凝剂来干预血栓的形成,可以降低心血管疾病发生的风险。水蛭素(Hirudin)有很强的凝血酶抑制作用和抗凝活性,但由于对凝血酶的强烈抑制,容易引起出血副作用。新蛭素(EPR-Hirudin,EH)是水蛭素的衍生物,是一种新型低出血风险的重组抗凝血蛋白。但由于半衰期短,患者需要多次给药来维持治疗效果。为延长EH半衰期,本研究将EH、人IgG-Fc和甘氨酸丝氨酸组成的连接肽以2种不同的方式进行融合表达,希望能够获得能明显延长EH半衰期,又不影响抗凝活性释放的融合蛋白。根据EH、人IgG4-Fc片段和连接肽的基因序列,优化合成适合在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行表达的融合基因序列。利用PCR扩增Fc-EH和Fc-L-EH融合基因片段,将Fc-EH和Fc-L-EH基因片段分别克隆至表达载体pcDNAHC上,构建重组表达载体。利用脂质体将重组质粒转到CHO细胞中,用MSX加压筛选高表达细胞株,ELISA检测培养上清液中两种蛋白表达的水平,Western Blot鉴定融合蛋白,经生物反应器扩大培养后收集培养上清,蛋白A亲和柱纯化两种融合蛋白,分别用Lowry法和SDS-PAGE法检测蛋白的浓度和纯度,质谱法检测两种融合蛋白的分子量和C端氨基酸序列,通过体外凝块法和大鼠颈静脉血栓模型分别验证融合蛋白的体外抗凝活性和体内抗栓效果,应用化学发光免疫方法(CLIA)检测融合蛋白半衰期。结果表明:成功构建了pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH两个重组表达载体,质谱结果显示融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH分子量分别为68476Da和70542Da,且C端测序正确,蛋白纯度分别为98.9%和97.8%,活性分别为256ATU/mg和64ATU/mg。大鼠颈静脉血栓模型实验结果表明,融合蛋白Fc-EH能有效抑制血栓的形成,血栓的湿重随着融合蛋白Fc-EH剂量的增加而减小;等摩尔剂量的EH和Fc-EH抗血栓效果相近。融合蛋白Fc-EH组动物的凝血参数PT和APTT值明显小于阳性对照药低分子肝素组。融合蛋白Fc-EH在大鼠体内的半衰期为33.9～53.9h。综上,本研究成功构建并表达了融合蛋白Fc-EH,其半衰期明显延长,大约是EH的20倍,而且该融合蛋白具有较高抗凝活性。这种长效融合蛋白为抗凝药的研究提供了一种新的思路。