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衣原体是革兰氏阴性专性细胞内寄生病原体，可引起人类和动物疾病。其中沙眼衣原体（C. trachomatis）是引起性传播疾病的主因之一，并且沙眼的致病因子是导致传染性失明的主要原因。
作为专性细胞内病原体，沙眼衣原体必须在真核细胞内存活足够的时间来完成其发育周期，从而感染宿主细胞。衣原体体生长发育是在称为包涵体的囊泡中完成的，其膜蛋白被称为包涵体膜蛋白（inclusion proteins，Incs），Incs占衣原体总基因组的7～10％，并且鉴于其在宿主和病原体之间的定位，保证包涵体膜的稳定性的同时促进宿主-病原体相互作用，调控宿主细胞的生命周期，可见其沙眼衣原体的发育和致病机制中扮演着重要的角色。近年来，对衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能的研究引起关注，但迄今为止仅有少数Incs已被实验证实可以与宿主蛋白相互作用产生生物学效应。CT227是已经实验证实的Incs，但对其具体的生物学功能还未见报导。在本实验中，我们利用酵母双杂交技术初步筛选了与CT227相互作用的宿主蛋白从而对其生物学功能有初步了解。
首先，从HeLa细胞中提取细胞总RNA，然后以RNA为模板， CDSШ、SMARTШ-modified olig-dT为引物，用SMART反转录酶合成cDNA的第一链，然后通过LD-PCR技术合成ds-cDNA，再将200bp以下的片段去除后得到纯化的ds-cDNA。在酵母感受态细胞Y187中将ds-cDNA与pGADT7-Rec、Yeast maker Carrier DNA进行重组，重组后的酵母菌液在SD/-Leu(Amp 50ug/ml)缺陷平板上培养3～5天后用冷冻培养基收集菌体，同时在平板中随机挑选20个阳性菌落，进行菌落PCR扩增，检测文库多态性，结果显示，PCR产物大小在1.3～3kb之间，文库多态性良好，同时将菌液稀释后涂于相应缺陷平板，培养3～5天后，计数阳性菌落，检测文库滴度。
其次，根据NCBI中CT227的基因信息设计引物后用沙眼衣原体基因组作为模板对目的基因进行扩增，将扩增得到的目的片段与诱饵载体空质粒pGBKT7进行基因重组，成功构建了pGBKT7-CT227重组诱饵载体。
同时，诱饵载体pGBKT7-CT227经检测无自激活及细胞毒性后，将诱饵质粒转化的AH109 菌株与构建好的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交，当出现三叶草（米奇）形状的结合子后，将菌液涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸营养缺陷(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)平板，培养箱中倒置培养进行初步筛选。将二次筛选阳性菌液点种在做好标记的无菌滤纸上，液氮中反复冻融三次后，将滤纸浸泡在 Z 缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal 混合液中，室温避光 8 h 显色，将滤纸中显色的对应菌落提取质粒后，进行PCR扩增，阳性者转到大肠杆菌感受态XL1-Blue。
最后，提取PCR阳性菌落质粒并将其转化到酵母菌株Y187中 ，与pGBKT7-CT227转化的AH109 菌落进行回交再验证，最后共得到15个回交阳性菌落。对最后阳性的菌落质粒进行测序分析，通过与基因库中同源序列比对确定筛选出来的配体基因。结果显示CT227与HeLa细胞cDNA文库发生相互作用的基因编码产物有细胞内胆固醇转运蛋白（NPC2），人层粘连蛋白受体（RPSA），甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，γ-肌动蛋白（ACTG1）。本实验初步筛选出了与CT227相互作用的配体基因，为进一步研究沙眼衣原体与宿主细胞相互作用及其致病机制打下了基础。
作为专性细胞内病原体，沙眼衣原体必须在真核细胞内存活足够的时间来完成其发育周期，从而感染宿主细胞。衣原体体生长发育是在称为包涵体的囊泡中完成的，其膜蛋白被称为包涵体膜蛋白（inclusion proteins，Incs），Incs占衣原体总基因组的7～10％，并且鉴于其在宿主和病原体之间的定位，保证包涵体膜的稳定性的同时促进宿主-病原体相互作用，调控宿主细胞的生命周期，可见其沙眼衣原体的发育和致病机制中扮演着重要的角色。近年来，对衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能的研究引起关注，但迄今为止仅有少数Incs已被实验证实可以与宿主蛋白相互作用产生生物学效应。CT227是已经实验证实的Incs，但对其具体的生物学功能还未见报导。在本实验中，我们利用酵母双杂交技术初步筛选了与CT227相互作用的宿主蛋白从而对其生物学功能有初步了解。
首先，从HeLa细胞中提取细胞总RNA，然后以RNA为模板， CDSШ、SMARTШ-modified olig-dT为引物，用SMART反转录酶合成cDNA的第一链，然后通过LD-PCR技术合成ds-cDNA，再将200bp以下的片段去除后得到纯化的ds-cDNA。在酵母感受态细胞Y187中将ds-cDNA与pGADT7-Rec、Yeast maker Carrier DNA进行重组，重组后的酵母菌液在SD/-Leu(Amp 50ug/ml)缺陷平板上培养3～5天后用冷冻培养基收集菌体，同时在平板中随机挑选20个阳性菌落，进行菌落PCR扩增，检测文库多态性，结果显示，PCR产物大小在1.3～3kb之间，文库多态性良好，同时将菌液稀释后涂于相应缺陷平板，培养3～5天后，计数阳性菌落，检测文库滴度。
其次，根据NCBI中CT227的基因信息设计引物后用沙眼衣原体基因组作为模板对目的基因进行扩增，将扩增得到的目的片段与诱饵载体空质粒pGBKT7进行基因重组，成功构建了pGBKT7-CT227重组诱饵载体。
同时，诱饵载体pGBKT7-CT227经检测无自激活及细胞毒性后，将诱饵质粒转化的AH109 菌株与构建好的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交，当出现三叶草（米奇）形状的结合子后，将菌液涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸营养缺陷(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)平板，培养箱中倒置培养进行初步筛选。将二次筛选阳性菌液点种在做好标记的无菌滤纸上，液氮中反复冻融三次后，将滤纸浸泡在 Z 缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal 混合液中，室温避光 8 h 显色，将滤纸中显色的对应菌落提取质粒后，进行PCR扩增，阳性者转到大肠杆菌感受态XL1-Blue。
最后，提取PCR阳性菌落质粒并将其转化到酵母菌株Y187中 ，与pGBKT7-CT227转化的AH109 菌落进行回交再验证，最后共得到15个回交阳性菌落。对最后阳性的菌落质粒进行测序分析，通过与基因库中同源序列比对确定筛选出来的配体基因。结果显示CT227与HeLa细胞cDNA文库发生相互作用的基因编码产物有细胞内胆固醇转运蛋白（NPC2），人层粘连蛋白受体（RPSA），甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，γ-肌动蛋白（ACTG1）。本实验初步筛选出了与CT227相互作用的配体基因，为进一步研究沙眼衣原体与宿主细胞相互作用及其致病机制打下了基础。