十字花科芸薹属的植物大白菜（Brassica campestris）是中国和东亚地区的一种常见的蔬菜。在栽培条件下，大白菜的营养生长周期可分为:幼苗期(Seedling stage)、莲座期(Rosette stage)和结球期(Heading stage)。在结球期，卷曲的叶片会形成一个包裹的叶球。叶球是大白菜的食用部分，因此，研究叶卷曲和叶球发生的遗传机制，能有助于我们更好地改良大白菜的品种，在农业应用上具有重要的意义。　　早在1996年，我们实验室利用差异杂交的方法在大白菜中分离和克隆了双链RNA结合蛋白基因BcpLH，并初步发现它与叶卷曲的发生相关(Yu等，2000)。此外，BcpLH在模式植物拟南芥中具有一个同源基因HYL1(HPONASTIC LEAVES1)。本项研究将综合国内外近年来叶极性和叶卷曲发生方面的最新进展，利用大白菜BcpLH基因和模式植物拟南芥同源基因HYL1，通过比较生物学的方法探讨叶卷曲发生的基因调控机制。　　正常的拟南芥的叶是平展的，HYL1的缺失是造成hyl1突变体叶卷曲的原因。大白菜结球期的叶片会发生内卷，提示我们BcpLH可能存在着某种缺陷，从而导致了大白菜的叶卷曲。蛋白结构分析的结果表明，BcpLH和HYL1有四个结构域，从N端起，这四个结构域依次是两个双链RNA结构域(dsRBD)，一个核定位信号结构域(NLS)，以及一个可能的蛋白-蛋白相互作用结构域(PPI)。为了分析这些结构域的生物学功能，我们构建了含有不同缺失片段的HYL1植物转化载体，并在拟南芥hyl1突变体中进行表达。转基因结果显示，含有两个双链RNA结合结构域的HYL1蛋白就能够完全恢复hyl1突变体的表型。为了验证这一结果，我们构建了pMAL-HYL1原核表达载体，在大肠杆菌中表达了MBP-HYL1融合蛋白，并通过麦芽糖亲和层析，分离纯化了HYL1蛋白，得到了HYL1的抗体。经过Western杂交，我们确认在恢复表型的转基因植株中，外源表达的HYL1蛋白确实存在。通过免疫共沉淀和体外剪切实验，我们发现含有两个双链RNA结合结构域的HYL1缺失蛋白的沉淀复合体中含有可能的DCL1蛋白，并具有将miRNA前体剪切成成熟miRNA的活性。此外，在洋葱表皮细胞中的瞬时表达实验发现，HYL1全长蛋白定位于细胞核内，而一旦缺失NLS序列之后，前两个dsRBD结构域就会进入细胞质中。此外，为了研究HYL1的调控因子，我们对HYL1进行了5RACE PCR实验，实验结果显示，HYL1存在着一个长为ATG后592 bp的转录本，转录本包含了两个双链RNA结构域，但不包含NLS和PPI结构域。在不同的小RNA突变体中，不同转录本的丰度不同，提示我们在拟南芥体内，可能存在着HYL1的某种剪切作用。　　在另一方面，为了研究大白菜BcpLH基因的生物学功能，我们构建了GFP融合的BcpLH不同结构域的转基因载体，并将它们转化了拟南芥hyl1突变体。通过转基因和细胞定位研究，我们发现不仅BcpLH能恢复hyl1的表型，BcpLH只含有N端两个dsRBD缺失蛋白也能够完全恢复hyl1的表型。此外，GFP荧光定位结果显示，BcpLH蛋白的各个结构域具有和HYL1蛋白各个结构域相似的亚细胞定位。这两方面的证据说明，BcpLH在功能上和HYL1没有差别，所以大白菜的叶卷曲不是由于BcpLH蛋白自身的功能缺陷所造成的。通过Real-Time PCR和Northern杂交的方法，我们分析了大白菜中BcpLH相关基因的表达。结果发现，在卷曲的球叶中，BcpLH的表达低于莲座期叶片。与此相对应，miR165/166水平也有所降低，而有些HD-ZIPⅢ靶基因的表达水平有明显提高。在BcpLH反义基因转基因大白菜株系NT27-88中，我们发现它的莲座叶也发生了卷曲，同时miR165水平降低了，而相关的HD-ZIPⅢ基因的表达，特别是BcpREV的表达，则有了明显的提高。这个结果说明，BcpLH基因的沉默会引起大白菜的莲座叶向内卷曲。　　但是，随着大白菜植株的生长，NT27-88却未能形成正常的叶球，球叶的卷曲程度与对照相比有所降低。从叶片卷曲的趋势来看，野生型大白菜从幼苗期的下卷向莲座期的平展和上卷转换，然后从莲座期的平展和上卷转换为结球期的内卷，且内卷程度不断提高。而NT27-88植株却没有这种趋势，其莲座期和结球期的叶片都是内卷的，伴随着结球期的消失，不同时期植株在形态上的差别不明显了。这提示我们，反义转基因植株中BcpLH基因的沉默改变了大白菜营养生长期的莲座期和结球期之间的时期转换，破坏了大白菜叶球形成的遗传基础。　　此外，我们还克隆了BcpREV的全长基因，并在拟南芥rev-6突变体中进行过量表达，我们发现BcpREV能够恢复rev-6的表型，说明它的功能和拟南芥REVOLUTA相同。在拟南芥野生型和hyl1突变体中过量表达BcpREV,特别是miR165结合位点突变的BcpREV基因，会造成植物在叶形态和原基发育上的缺陷。说明BcpREV具有调控植物叶发育和原基发育的功能。　　综上所述，大白菜BcpLH基因的表达是受发育调控的，在莲座期高水平表达，相应的叶片中miR165含量较高，REV基因表达产物的极性分布保持了叶的极性，叶片是平展的;在结球期BcpLH基因的表达减弱，就像hyl1突变体一样，叶片中miR165含量降低，BcpREV基因表达扩大造成了叶极性的紊乱，从而使叶卷曲。与此同时，BcpLH基因表达区域以及表达量的变化引起其他基因时空表达模式的改变，使大白菜从莲座期进入了结球期，叶球开始形成。但是，大白菜叶球形成过程可能是一个复杂的调控网络，还有我们尚未知的基因参与其中。