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第一章大鼠视网膜Muller细胞的原代培养及纯化目的：对大鼠视网膜Muller细胞进行原代培养并改良其纯化方法,以得到高纯度的Muller细胞。方法：取出生10-21天SD大鼠,显微镜下分离视网膜,经胰酶消化后置于含10%FBS的DMEM培养基中培养,6-8天后换液,将视网膜细胞分为A、B两组,A组行完全胰酶消化法传代培养,B组行反复不完全胰酶消化法传代培养。观察两组细胞的生长情况,培养一个月后行免疫荧光组织化学检测、荧光激活流式细胞分选仪(FACS)及RT-PCR对两组细胞进行检测,比较两组视网膜Muller细胞的纯度。结果：细胞培养一个月后,FACS分析显示,A组获得视网膜Muller细胞的纯度为75.41%,而B组获得视网膜Muller细胞的纯度高达98.01%。RT-PCR结果显示B组中视网膜Muller细胞的表达物(GS、Vimentin、Clusterin、Carbonic anhydrase)高于A组；而视网膜其他细胞的标志物B组无表达,A组少量表达。荧光显微镜10倍下各组分别选取10个非重叠视野,计算表达GS的细胞阳性率。A组GS阳性表达率为83.20%±5.16%,B组GS的阳性表达率为98.50%±1.08%,采用两样本近似t检验统计学分析,t=-9.178,P<0.005,两种方法差异有统计学意义。结论：相对于完全胰酶消化传代法,反复不完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Muller细胞,且纯化后的细胞具有形态规则、分布均匀等特点。第二章视网膜干细胞的培养及鉴定目的：通过体外去分化诱导,将视网膜Muller细胞培养成视网膜干细胞,并进行鉴定。方法：取用反复不完全胰酶消化传代法培养一个月第3代的视网膜Muller细胞,在去分化培养基(含1×N2,2×B27,20ng/ml EGF,10ng/ml bFGF)中培养,诱导去分化。通过在倒置相差显微镜下观察细胞成团形态,免疫细胞化学反应、RT-PCR、Wester blot检测视网膜干细胞特异性表达产物Pax6和Nestin的表达；Edu染色检测细胞增殖能力。结果：去分化培养3-7天,细胞聚集成球表现出神经干细胞特性,传2-3代后仍表现出较强的增殖能力。免疫荧光细胞化学检测显示,神经球中Pax6的阳性率为92.94%±6.48%,Nestin的阳性率85.96%±6.04%; RT-PCR及Western blot显示,神经球大量表达Pax6和Nestin相关mRNA及蛋白产物。Edu染色显示神经球内细胞具有增殖能力。结论：鼠Muller细胞在去分化培养基中能去分化为具有自我更新和增殖能力的视网膜神经干细胞。第三章Math5对视网膜干细胞向神经节细胞分化的调控目的：探讨Math5基因转染视网膜干细胞后对其向神经节细胞分化的调控作用。方法：体外培养视网膜Muller细胞,将高纯度的视网膜Muller细胞去分化培养为视网膜干细胞；构建PGC-FU-Math5-GFP慢病毒,将细胞分组：PGC-FU-Math5-GFP慢病毒转染组、PGC-FU-GFP空载体转染组及未转染组。用倒置相差显微镜每天观察转染后的视网膜干细胞,转染后置于分化培养基(DMEM/F12, lng/mL BDNF, luMRA,1%FBS)中继续培养,7天后采用免疫荧光化学检测神经节细胞特异性标志物Brn3b并计数,采用单因素方差进行统计学分析。结果：PGC-FU-Math5-GFP慢病毒转染组中神经节细胞阳性率为50.40±8.22%, PGC-FU-GFP空载体组中神经节细胞阳性率为13.3±13.25%,未转染组中神经节细胞阳性率为9.10±3.21%。PGC-FU-Math5-GFP慢病毒转染组与PGC-FU-GFP空载体组和未转染组比较,差异有统计学意义(F=61.642,P<0.001),而PGC-FU-GFP空载体组与未转染组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：Math5对神经节细胞的分化有正向调控作用,能促进神经干细胞向神经节细胞分化。