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脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）指创伤等各种原因造成的脊髓受损,导致损伤平面以下运动、感觉和自主神功能经暂时或永久性障碍。目前临床常用的各种疗法均疗效有限。近年来,细胞替代疗法已经成为SCI最有希望的疗法之一。神经干细胞（Neural stem cell,NSC）可自我更新并分化为各类神经细胞从而替代或补充SCI后死亡的细胞起到神经修复作用。但由于外源性细胞存在伦理、来源、免疫排斥和致瘤性等问题,制约了其临床应用前景,激活内源性NSC参与SCI后神经修复就成为了研究的热点。嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cell,OEC）具有增殖、成鞘、分泌细胞因子等作用,这使OEC成为SCI细胞移植最具前景的候选细胞。我们前期研究证明OEC可以促进NSC增殖,但OEC能否在髓内激活内源性NSC增殖尚待证实。Notch信号通路在NSC增殖分化的调控中起到主要作用。表达Notch受的和配体Delta的细胞相互作用,介导“旁侧抑制”机制,决定细胞分化方向。作为胶质细胞的OEC移植到脊髓内是否也能通过Notch-Delta信号调控NSC的增殖目前尚未见报道。基于此我们提出OEC移植可以通过Notch-Delta信号抑制内源性NSC Notch信号通路激活促进其增殖,从而参与脊髓损伤后神经再生和修复。为此本研究将从以下三个方面进行研究:1.OEC移植对SCI的治疗作用目的通过观察OEC移植对大鼠运动和自主神经功能、脊髓组织结构、内源性NSC激活、新生神经元和突触变化的影响,明确OEC移植治疗SCI的疗效。方法建立SCI大鼠模型,分为sham组、SCI组、SCI+OEC-CM组、SCI+OEC组。sham组大鼠仅行T10椎板切除手术,其余3组制作SCI模型。术后分组给予移植治疗。SCI组:注射OEC完全培养液;SCI+OEC组:OEC悬液,浓度1.0×105 cells/μL;SCI+OEC-CM组:注射预留的OEC条件培养基;各4μL。术后1-4周测定BBB评分、交感神经皮肤反应（SSR）评价运动和自主神经功能。术后4周对取损伤处脊髓,行HE染色、尼氏染色、LFB染色观察SCI大鼠脊髓组织结构变化。采用免疫组化、免疫荧光、western blot检测神经干细胞标记物Nestin、新生神经元标记物DCX、神经元标记物NF200、星形胶质细胞标记物GFAP、和突触标记物SYP表达水平。结果（1）SCI后各组大鼠BBB评分均明显显著降低。各时间点SCI+OEC组BBB评分较SCI组和SCI+OEC-CM组均显著增高。（2）SSR测定结果:SCI后大鼠SSR引出率下降,可引出SSR的大鼠损伤平面以下SSR潜伏期延长、波幅降低。SCI+OEC组大鼠潜伏期、波幅变化与SCI组和SCI+OEC-CM组相比明显减轻。（3）HE染色可见SCI+OEC组脊髓组织结构较完整,尼氏染色神经元数量、LFB相对染色面积均高于SCI组和SCI+OEC-CM组。免疫荧光染色和Western blot均显示SCI+OEC组大鼠脊髓Nestin、NF200、DCX、SYP蛋白表达增加,GFAP表达减少与其他3组相比差异有统计学意义。结论OEC促进脊髓内NSC增殖,生成新生神经元和突触,改善SCI大鼠运动和自主神经功能。2.OEC对SCI后内源性NSC增殖分化的影响目的体外共培养OEC和NSC,并提取损伤脊髓上清液模拟损伤脊髓微环境,探讨不同微环境中OEC对NSC增殖、分化的影响。方法（1）正常微环境细胞分组:NSC+OEC组、NSC+OEC-CM组、NSC组。SCI微环境细胞分组:naive-h、SCI-h和SCI-h+OEC组。共培养5天,采用CCK-8法和细胞计数法测定NSC增殖情况。（2）采用血清和OEC诱导NSC分化,培养5天后采用GFAP和β-Ⅲ tubulin免疫荧光双染,Image J测定GFAP+和β-Ⅲ tubulin+细胞比例评价NSC分化情况。结果（1）正常微环境共培养5天,细胞计数和CCK-8结果示NSC+OEC组细胞数和OD值均高于NSC组和NSC+OEC-CM组（P＜0.05）。其余两组相比无显著差异。（2）SCI微环境中,SCI-h+OEC组在各时间点的细胞数和OD值均显著高于其他两组（P＜0.05）。naive-h组和SCI-h组比较无统计学差异。（3）免疫荧光结果示与NSC+OEC组NSC向神经元分化比例较NSC+血清组增加。结论正常微环境和SCI微环境中,OEC均可促进NSC增殖并向神经元方向分化。2.Notch信号通路在OEC激活内源性NSC增殖分化中的作用目的明确OEC是否通过调控Notch信号通路来诱导内源性NSC增殖,并探讨OEC调节Notch信号通路的机制。方法（1）制作撞击型SCI大鼠模型,采用qPCR和western blot测定SCI后1-7天大鼠脊髓Notch信号通路mRNA和蛋白表达变化。（2）通过正常微环境和SCI微环境中共培养OEC和NSC,并建立SCI大鼠模型给予OEC移植,通过qPCR和western blot检测Notch信号通路表达变化。（3）分别通过siRNA干扰OEC的Notch3和NSC的DLL1（Delta 1）表达,CCK-8法和细胞计数法测定NSC增殖情况,Western blot测定Hes1表达水平。结果（1）损伤后第3天Notch2、Hes1、RBP mRNA和蛋白表达量达高峰（P＜0.05）,第7天表达下降至正常,β-Ⅲ tubulin和CD133表达明显降低（P＜0.05）,GFAP无显著变化。（2）正常微环境中共培养3天,与NSC组相比,NSC+OEC组Notch2、Hes1 mRNA和蛋白表达明显降低。SCI微环境中培养3天SCI-h组Notch2、RBP、Hes1mRNA和蛋白表达增加,与naive-h组相比有统计学差异。SCI-h+OEC组与SCI-h组相比,Notch2、RBP、Hes1蛋白表达降低,有统计学差异。髓内OEC移植实验,与sham组相比,Notch2、RBP和Hes1 mRNA和蛋白表达明显增高。与SCI组和SCI+OEC-CM组相比,SCI+OEC组Notch1、Notch2、RBP、Hes1 mRNA和蛋白表达下降,mash1表达上升,差异有统计学意义。（3）生长曲线和CCK-8试验结果均显示siRNA干扰后NSC增殖降低,差异有统计学意义。Western blot结果显示,siRNA分别干扰Notch3和DLL1后细胞Hes1表达水平明显高于NC组,差异有统计学意义。结论SCI可激活Notch信号通路。OEC与NSC共培养和髓内OEC移植均可通过Notch3-DLL1抑制Notch信号通路激活。总结OEC通过Notch3-DLL1信号抑制NSC的Notch信号通路激活从而促进脊髓内源性NSC增殖、生成新生神经元和突触,从而提高SCI大鼠运动和自主神经功能。