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将蛋白质引入哺乳动物细胞的方法有很多，常用的有真核表达载体转染、微注射、病毒感染等等。这些方法也许在某一特定的情况下非常适用，但其都不免操作复杂，难于调控。解决办法之一就是应用蛋白转导域(Proteintransduction domain,PTD)。将PTD与蛋白质、多肽或DNA等分子共价连接或与目的基因融合表达后，PTD可将这些分子以一种不依赖受体和转运蛋白的方式导入细胞。来源于HIV的TatPTD就是一种转导能力很强的蛋白转导域(本研究中简称TAT)。实验证明TAT融合蛋白可导入小鼠体内的所有组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障。因此，TAT蛋白转导系统被认为是一种很有前途的运载工具，无论对于基础研究还是临床治疗，都有着非常广泛的应用前景。 为了探索应用PTD将乙肝病毒靶向核糖核酸酶导入人体治疗乙型肝炎的可行性，本研究中首先将乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targetedribonuclease,TR)基因及其对照—突变失活的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(mutant targeted ribonuclease,TRmut)基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV coreprotein,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，分别克隆入含有蛋白转导域TAT的pTAT-HA原核表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内，以IPTG诱导融合蛋白表达，表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。优化表达条件后大量第四军医大学硕士学位论文 中文摘要表达，在变性条件下以 Ni－NTA仓grose和 PD八 脱盐柱进行纯化。纯化产物的浓度及纯度分析表明，成功地纯化了四种TAT融合蛋白。以构建的PET30a（＋）／TR、pET30a（＋）／TRmut及pET30a（＋）／HBVc转化大肠杆菌BLZI （DE3）LySS，相同方法表达并纯化不含TAT的对照蛋白。将四种TAT融合蛋白及其对照分别加入培养的2．2．15细胞上清中，利用间接免疫荧光法检测TAT融合蛋白的跨膜转导效率发现：经TAT融合蛋白处理的细胞，胞浆中均出现较强的绿色荧光；而经不含TAT的对照蛋白处理的细胞则没有荧光出现。这一结果显示制备的TAT融合蛋白可以高效的导入2．2二5细胞。我们采用固相放免法检测TATTR的抗病毒活性发现：与MOCK组相比加有TATTR的实验组细胞上清中 HBeAg的浓度下降了 60．3％；而TRmut、hEDN和 HBVc组细胞上清中的HBeAg浓度与MOCK组的差异无统计学意义，说明制备的TATTR具有较好的抗病毒活性。MTT检测结果显示TATTR并不影响细胞的生长及代谢。由此我们得出结论：TAT乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的制备及其抗病毒作用的初步研究，为应用靶向核糖核酸酶治疗乙肝病毒感染奠定了基础。