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近几十年来,各种变态反应性疾病如过敏性鼻炎、皮炎、支气管哮喘和变应性结膜炎等的流行呈逐年上升趋势[1],已成为全球性的健康问题[2]。变态反应性疾病是接触变应原后人体产生的一种免疫病理反应过程[3]。现有资料证明[4],尘螨是引起变态反应性疾病最重要的变应原之一。而尘螨中又以粉尘螨(Dermatophagoides farinae,Df)和屋尘螨(Dermatogoides pteronyssinus,Dp)数量最多、分布最广、危害最大[5-7]。但是一方面屋尘螨和粉尘螨的分布不完全相同,另一方面两者又常在同一环境中同时存在,因此了解某一地区或环境中尘螨的种类和优势螨种,对过敏性疾病的诊断、预防和治疗是非常重要的。本研究尝试用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测。研究目的由于粉尘螨和屋尘螨在室内分布广泛,并且二者在形态上非常接近,用传统的方法进行鉴别或检测存在困难或较为麻烦,因此本研究尝试用PCR的方法对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测。研究方法:(1)粉尘螨和屋尘螨DNA提取用酚-氯仿法分别提取粉尘螨和屋尘螨的DNA(2)随机引物PCR扩增用设计的六条随机引物RP1、RP2、PR3、RP4、RP5和PR6单独或两两配对,对两种尘螨DNA进行PCR扩增。通过比对同一引物扩增两种尘螨结果,验证随机引物PCR方法是否能够对两种尘螨进行鉴别。(3)测序从随机引物PCR反应结果中选择了三条具有鉴别及检测粉尘螨和屋尘螨潜力的DNA扩增条带进行测序和分析。(4) PCR引物设计根据测序结果,设计特异性引物用于粉尘螨和屋尘螨的鉴别及检测。(5) PCR扩增粉尘螨和屋尘螨用新设计的引物分别对粉尘螨和屋尘螨DNA进行PCR扩增。(6) PCR反应的特异性用新设计的屋尘螨引物扩增粉尘螨DNA,粉尘螨引物扩增屋尘螨DNA,观察这些引物的特异性。(7) PCR反应的敏感性对粉尘螨和屋尘螨的DNA模板进行稀释,取稀释后的DNA模板进行PCR扩增反应,以初步估计该检测方法的敏感性。(8) PCR检测方法的优化通过减少循环中的各部分反应时间和减少反应循环数两种方式对PCR反应条件进行优化,缩短检测所需时间。研究结果:(1)粉尘螨和屋尘螨DNA提取获得的粉尘螨和屋尘螨DNA OD260/OD280分别为1.86和1.78,表明其具有较高的纯度,可进一步用于PCR实验。(2)随机引物PCR扩增六条引物单独或配对进行PCR反应共九种情况的扩增结果比对可见,同一引物扩增粉尘螨和屋尘螨时扩增条带均存在不同程度的差别。提示随机引物PCR方法可用于两种尘螨的鉴别。其中,RP1、RP3配对扩增,粉尘螨在500bp和750bp左右均有明显条带;而屋尘螨仅500bp左右条带较清晰,无大于500bp的扩增产物出现。因此选定这对引物的扩增产物进一步用于两种螨的鉴别和检测研究。(3)测序测定了三个大小分别为502bp、666bp和500bp DNA片段的序列结构,同源性分析未发现与之高度同源的序列。(4) PCR引物设计根据测序结果,共设计三对特异引物:两对为扩增粉尘螨引物f1、f2及f3、f4,预计扩增产物长度分别为478bp和657bp,扩增屋尘螨引物p1、p2的预计扩增产物长度为328bp。(5) PCR扩增粉尘螨和屋尘螨f3、f4及p1、p2引物PCR扩增粉尘螨和屋尘螨的产物长度与预期大小一致,而f1、f2扩增无明显条带出现。故f3、f4及p1、p2可用于两种尘螨的鉴别和检测。(6) PCR反应特异性用上述两对引物进行交叉PCR扩增,无论是粉尘螨还是屋尘螨均无明显条带出现。表明引物具有较好的特异性。(7) PCR反应敏感性用新设计的引物进行PCR可从相当于1.5只尘螨的DNA模板中扩增出粉尘螨和屋尘螨相应的目的条带,表明该检测方法具有较好的敏感性。(8) PCR检测方法的优化缩短循环中各部分反应时间后,粉尘螨和屋尘螨均可扩增出目的条带;将循环次数从45减少至35或40后,二者仍然可以扩增出目的条带。结论:(1)本研究结果表明:选用适当的随机引物和进行引物的配对筛选,可建立随机引物PCR技术方法,从基因水平上对粉尘螨和屋尘螨进行有效鉴别。(2)测定了三个粉尘螨和屋尘螨的DNA片段,经同源分析无与之高度同源序列,因此这三个片段有可能是新的基因片段。另外,粉尘螨和屋尘螨由同一对随机引物扩增产生的、大小非常接近(约500bp)的产物,测序发现二者并非相同或相似的DNA片段。(3)新的特异引物用于两种尘螨的扩增有较好的效果,并具有从环境样本中对二者进行鉴别和检测的潜力。(4)PCR检测方法的优化结果提示粉尘螨和屋尘螨的PCR检测反应时间可通过优化而缩短,达到快速检测的目的。