论文部分内容阅读
动脉粥样硬化是血管壁的慢性炎症性病变,大量的研究表明TNF-α作为多功能的炎症细胞因子,可以导致内皮细胞的功能和形态发生改变,是动脉粥样硬化病变过程中的重要因子,另有研究指出神经轴突导向分子Slit2蛋白具有抗炎作用。因此本研究用TNF-α刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以模拟内皮细胞的炎症反应,以Slit2蛋白作为抗炎因子,观察炎症介质IL-8、ICAM-1、VCAM-1表达的变化,以探讨Slit2蛋白介导的信号通路在抑制TNF-α介导的内皮细胞炎症反应中的可能机制。本实验共分为以下三个部分:第一部分:Slit2及其受体Robo1、Robo4在人脐静脉内皮细胞上的表达目的:检测Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白在HUVECs上的表达。方法:用Semi-quantitative RT PCR(RT-PCR)及Western Blot技术检测体外培养人脐静脉内皮细胞Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白表达情况。结果:体外培养的人脐静脉内皮细胞表达Slit2、Robo1、Robo4基因及蛋白。结论:人脐静脉内皮细胞表达Slit2、Robo1、Robo4。第二部分:Slit2蛋白对TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞炎症介质IL-8、ICAM-1、VCAM-1表达的影响目的:探讨Slit2蛋白对TNF-α介导的内皮细胞炎症介质表达的影响。方法:1.人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、阳性对照组和实验组。正常对照组(NC组):培养基中不加TNF-α。阳性对照组(TNF-α组):培养基中TNF-α的浓度分别为1μg/L、10μg/L、100μg/L。实验组(TNF-α+Slit2组):培养基中分别含10μg/L的TNF-α和不同浓度梯度的Slit2蛋白(25、50、100、200μg/L),各组细胞培养24h后用real-time PCR和Eliasa技术检测IL-8基因及蛋白的表达。2.人脐静脉内皮细胞分为正常对照组(NC组):培养基中不含TNF-α和Slit2;阳性对照组(TNF-α组):培养基中TNF-α的终浓度为10μg/L;实验组(TNF-α+Slit2组):培养基中含有10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2,分别将各组细胞培养24h后,采用real-time PCR及Western Blot方法检测ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表达。结果:1.与NC组比较,10μg/L的TNF-α可上调人脐静脉内皮细胞IL-8m RNA的表达,并促进IL-8的分泌(P(27)01.0)。2.Slit2蛋白的浓度为50μg/L、100μg/L、200μg/L时可以抑制TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞IL-8的基因及蛋白的表达(P(27)05.0),并且Slit2蛋白的浓度为100μg/L时抑制作用更明显(P(27)01.0)。3.100μg/L Slit2可抑制TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1、ICAM-1基因及蛋白的表达(P(27)01.0)。结论:1.Slit2可以抑制TNF-α介导的内皮细胞炎症介质IL-8的分泌;2.Slit2对TNF-α引起的内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的上调具有抑制作用。第三部分:Slit2蛋白及其受体Robo抑制TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞炎症反应的机制探讨目的:1.探讨Slit2蛋白在抑制人脐静脉内皮细胞炎症反应中的受体是Robo1或Robo4 2.初步探讨Slit2蛋白抑制人脐静脉内皮细胞炎症反应的可能机制。方法:1.利用si RNA技术沉默内皮细胞Robo1或Robo4蛋白的表达。针对Robo1、Robo4基因序列的三个不同位点,设计三段不同的si RNA序列,分别命名为Robo1-si RNA-1、Robo1-si RNA-2、Robo1-si RNA-3,Robo4-si RNA-1、Robo4-si RNA-2、Robo4-si RNA-3。细胞分为以下三组:正常对照组(NC组);阴性对照组(NT-si RNA组);实验组:细胞分别转染Robo1-si RNA和Robo4-si RNA。将各组细胞培养48小时后,利用real-time及Western Blot检测Robo1、Robo4基因和蛋白的表达,筛选最佳转染位点。2.转染后的细胞分为以下三组:(1)转染NT-si RNA组:(1)阴性对照组:培养基中不含TNF-α和Slit2;(2)TNF-α组:培养基中含10μg/L的TNF-α;(3)TNF-α+Slit2组:培养基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2;(2)转染Robo1-si RNA组:培养基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2;(3)转染Robo4-si RNA:培养基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2。分别将各组细胞培养24小时后,用real-time PCR及Western Blot检测各组细胞细胞炎症介质ICAM-1及VCAM-1的表达,3.将细胞分为正常对照组:培养基中不含TNF-α和Slit2;阳性对照组(TNF-α组):培养基中含10μg/L的TNF-α;实验组(TNF-α+Slit2组):培养基中含10μg/L的TNF-α和100μg/L的Slit2,分别在加入Slit2蛋白后的1h、2h、4h提取各组细胞蛋白,利用Western Blot检测各组细胞各时间点IKBa、p-IKBa、NF-k B、p-NF-k B的表达变化。结果:1.人脐静脉内皮细胞转染Robo1-si RNA-1或Robo4-si RNA-1后分别可以沉默Robo1或Robo4蛋白的表达。2.TNF-α+Slit2+NT-si RNA组与TNFα+NT-si RNA组比较,Slit2可以抑制ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表达(P(27)05.0)。3.TNF-α+NT-si RNA组与转染Robo1组比较ICAM-1、VCAM-1基因及蛋白的表达降低(P(27)05.0),与转染Robo4组比较,ICAM-1及VCAM-1基因及蛋白的表达无统计学差异(P(29)05.0)。4.转染Robo1组与转染Robo4组比较,后者的ICAM-1及VCAM-1基因及蛋白表达量增高(P(27)05.0),5.各组细胞培养2小时后,TNF-α+slit2组与TNF-α组比较,TNF-α+slit2组p-IKBa及p-NF-k B表达量明显减少,差异有统计学意义(P(27)05.0)。各组细胞培养1h和4h时,TNF-α组与TNF-α+Slit2组比较,IKBa、p-IKBa、NF-k B、p-NF-k B蛋白的表达差异无统计学意义(P(29)05.0)。结论:1.Slit2蛋白与受体Robo4结合,抑制TNF-α引起的炎症介质ICAM-1、VCAM-1的表达上调。2.Slit2-Robo4信号通路可减少炎症反应中IKBa和NF-k B的磷酸化,从而抑制TNF-α在炎症中的作用。