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目的 细胞毒性细胞(主要包括CTL，即CD8~+T淋巴细胞和NK细胞)杀伤、清除病毒感染细胞及病毒是机体对病毒感染的重要防御机制之一，在许多病毒感染的控制中有重要作用。但在HIV感染中发挥的作用却有限，未能最终控制病情的发展。许多研究表明HIV特异性CTL的功能缺陷的机制之一是HIV特异性CTL成熟缺陷，穿孔素表达减少。穿孔素是细胞毒性细胞杀伤靶细胞的重要效应分子，其表达减少直接影响细胞免疫对HIV的清除作用，从而影响艾滋病的病情。但是穿孔素在HIV感染中的确切作用机制还不清楚，直接补充穿孔素是否可以用于艾滋病生物治疗也尚待进一步研究。鉴于此，本研究利用大肠杆菌表达系统将穿孔素可能的活性片段(全序列、MAC1即28-349aa、MAC2即166-369aa、C-100、N-60)进行表达，通过观察其对HIV感染CD4~+T细胞的影响，从体外实验来探讨穿孔素在艾滋病发病中的作用，并为证实穿孔素可能具有的艾滋病生物治疗作用奠定研究基础。 材料与方法 (1)以穿孔素保存质粒HP为模板，通过PCR方法扩增获得穿孔素各候选活性片段，全序列(不含信号肽部分)为HP1、MAC1即28-349aa为HP2、MAC2即166-369aa为HP3、C-100为HP4、N-60为HP5，将五段靶基因亚克隆入pGEM-T载体，筛选阳性质粒，经酶切鉴定后测序。 (2)将测序正确的目的基因克隆入表达载体，pET-DsbA作为HP1、HP2、HP3、HP5的表达载体，PET-41a(+)作为HP4的表达载体。筛选的阳性重组表达质粒转化表达菌E.coliBL21(DE3)plysS，IPTG诱导重组质粒表达。表达的融合蛋白经Ni-NTA柱亲和层析纯化，获得重组穿孔素各候选活性片段。 (3)通过对人红细胞溶解实验检测各穿孔素候选活性片段的功能。 (4)用纯化的全长穿孔素融合蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清，免疫双扩法检测抗体效价，Westernblot法对重组穿孔素各候选活性片段与免疫血清结合的特异汕头大学医学院博士研究生学位论文性进行检测。 (5)观察重组穿孔素活性片段对MT4细胞和HIV一15。。感染MT4细胞的影响:本部分实验共分12组:M对照、MI、MZ、M3、M4、MS组分别为MT4细胞被DsbA、HPI、HPZ、HP3、HP4、HPS处理;H对照、Hl、HZ、H3、H4、HS组分别为HIV一1503感染的MT4细胞被DsbA、HPI、HPZ、HP3、HP4、HPS处理，重组穿孔素活性片段处理24h后，使用MTT法观察细胞的增殖率、流式细胞仪检测细胞周期、激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度、P24试剂盒检测HIV抗原表达情况，光镜和电镜观察细胞形态改变，免疫组化检测穿孔素活性片段作用细胞后的定位情况。结果(1)PCR扩增获得穿孔素各候选活性片段，HPI、HPZ、HP3、HP4、HPS大小分别1605bp、963bp、609bp、300bp、180bp，成功亚克隆入pGEM一T载体，经测序证明穿孔素序列正确。 (2)酶切鉴定表明各穿孔素候选活性片段重组表达质粒构建成功，开放读码框正确。经诱导表达和纯化后，得到高纯度的融合蛋白，SDS一PAGE结果显示穿孔素各候选活性片段融合蛋白分子量大小:HPI约81.7kD、HPZ约58kD、HP3约45kD、HP4约44kD、HPS约29.6kD，并且1L培养基中重组蛋白表达量可达15mg一ZOmg。 (3)红细胞溶解实验检测穿孔素候选活性片段的功能，结果显示HPZ、HPS有红细胞膜穿孔的活性，且溶血率与浓度有关。 (4)免疫双扩法检测穿孔素融合蛋白的多克隆抗体效价，可达1:32，Westernblot结果显示抗血清可以与表达的穿孔素各候选活性片段发生特异性结合。 (5)通过一系列指标观察重组穿孔素活性片段对Hlv一lsF33感染MT4细胞及MT4细胞的影响，结果显示HPZ、HPS融合蛋白可导致细胞表面孔形成;细胞器肿胀，细胞内钙离子增多;在一定的浓度范围内，表现为促MT4细胞增殖作用，且这种促增殖作用有浓度依赖性，浓度越高，促增殖作用越明显;且对HIV的P24抗原表达无影响。并且结果显示穿孔素活性片段对MT4细胞和HIV一lsF。。感染的MT4细胞都有作用。结论(1)本研究利用大肠杆菌表达体系系统地对穿孔素各候选活性片段进行原核表达，获得的重组穿孔素片段N一60、琳Cl(28一349aa)具有靶细胞膜穿孔的活性。为穿孔素的进一步生物治疗应用奠定研究基础。 (2)首次通过体外实验观察穿孔素活性片段对MT4细胞和H工V一1503感染MT4细胞汕头大学医学院博士研究生学位论文的影响来探讨穿孔素在艾滋病发病中的作用和可能的生物治疗应用。结果显示穿孔素活性片段对有核细胞具有膜穿孔和细胞内通透性增高的活性;并且研究结果还显示，穿孔素体外促进CD4+T细胞的增殖，这些结果提示穿孔素表达减少在艾滋病发病中有一定的作用，可能与体内cD4+T细胞的丢失有关，通过补充体内穿孔素的不足进行艾滋病生物治疗前景可观。但研究结果同时显示穿孔素的体外作用缺乏选择性，不能直接抑制HIV的复制，因此如何使穿孔素的作用具有靶向性，如何将补充的穿孔素与颗粒酶等其他免疫因子作用协同起来共同清除病毒也是其引入艾滋病治疗必须考虑的因素。