研究背景:三氧化二砷是治疗急性早幼粒细胞白血病的常用药物,但是其对实体肿瘤的治疗一直受限于高剂量所致的毒副作用以及肿瘤细胞的化疗药物抵抗作用。作者团队发现二甲双胍对三氧化二砷药物增敏效果显著高于吉西他滨、5-FU、索拉菲尼等几种胆管癌常用药物。肝内胆管癌是肝脏的第二大恶性肿瘤,患者预后极差,化疗敏感性低,如何找到低毒有效的治疗药物,是当前临床医生所面临的棘手难题。此外,三氧化二砷常引起一些较为严重的治疗副反应,如肝毒性、皮肤病、神经毒性、肾毒性和心脏毒性等,常常限制了三氧化二砷的临床应用。肝脏是三氧化二砷作用的主要器官,三氧化二砷可通过诱导ROS产生,损伤肝细胞。此外,二甲双胍通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ产生的少量内源性的ROS可以延长线虫的寿命,其机制可能与二甲双胍间接诱导产生的过氧化物酶PRDX-2有关。研究目的:1.探索二甲双胍联合三氧化二砷对肝内胆管癌的抑制作用。2.探索二甲双胍联合三氧化二砷对肝内胆管癌的抑制作用的分子机制。3.探索二甲双胍对三氧化二砷引起的肝细胞损伤的保护作用。研究方法:1.通过细胞活性试验、流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期、细胞内活性氧水平和裸鼠移植瘤抑制试验等,在细胞和动物水平,证明二甲双胍联合三氧化二砷对肝内胆管癌细胞的增殖抑制作用,并计算两药抑制肿瘤细胞的协同系数。2.我们用western blot技术检测了二甲双胍和三氧化二砷处理后肝内胆管细胞癌内AMPK、p38MAPK、ERK3和mTOR通路的变化;细胞水平上,我们通过基因沉默、过表达及激酶抑制剂和激活剂的手段先后分别下调和上调AMPK、p38MAPK及ERK3蛋白的表达或活性,检测二甲双胍和三氧化二砷处理后胆管癌细胞的功能学及相关蛋白的表达变化;在73例肝内胆管癌患者肿瘤组织中检测了ERK3蛋白的表达水平,分析其与患者临床病理指标及预后的关系。3.用小鼠正常肝细胞AML12和昆明小鼠构建三氧化二砷肝损伤的细胞和小鼠模型。检测细胞凋亡、死亡和细胞内活性氧水平;检测肝脏组织学变化、肝酶、细胞凋亡等指标;基因芯片检测二甲双胍联合三氧化二砷处理后AML12细胞基因表达谱变化,seahorse系统检测细胞糖代谢变化。低糖或鱼藤酮处理AML12细胞后,检测细胞凋亡、死亡和细胞内活性氧水平。结果1.二甲双胍和三氧化二砷协同抑制肝内胆管癌细胞增殖;二甲双胍联合三氧化二砷有效抑制肝内胆管癌细胞裸鼠移植瘤增殖。2.二甲双胍联合三氧化二砷可能通过抑制mTORCl的活性来抑制胆管细胞癌增殖。二甲双胍可抑制三氧化二砷引起的p38MAPK的活化,下调或者抑制p38MAPK可以增强二甲双胍联合三氧化二砷抑制肝内胆管癌细胞的作用,二甲双胍和三氧化二砷能通过激活AMPK上调ERK3蛋白的表达,ERK3可以抑制mTORC1的活化。激活AMPK可抑制p38MAPK,上调ERK3表达。肿瘤组织中ERK3蛋白低表达是肝内胆管癌患者预后的独立危险因素。3.二甲双胍抑制三氧化二砷诱导的AML12细胞凋亡,减轻三氧化二砷引起的小鼠肝损伤。调控葡萄糖代谢可能是二甲双胍对三氧化二砷处理的AML12细胞的发挥保护作用的关键机制。低糖处理或鱼藤酮可有效缓解三氧化二砷诱导AML12细胞凋亡性坏死。对线粒体呼吸链复合物Ⅰ的抑制作用介导了二甲双胍对三氧化二砷诱导的AML12细胞凋亡性坏死的保护作用。二甲双胍增加AML12细胞内NADH/NAD+比例。结论1.二甲双胍联合三氧化二砷具有协同抑制肝内胆管癌的作用,该作用可能与两药可共同促进细胞周期阻滞于G0/G1期,促进细胞内ROS升高,诱导肝内胆管癌细胞凋亡有关。2.二甲双胍和三氧化二砷可通过AMPK/p38 MAPK-ERK3/mTORC1通路在体内和体外抑制肝内胆管癌细胞增殖。肿瘤组织中ERK3蛋白低表达是肝内胆管癌患者预后的独立危险因素。p38MAPK的活性和E)RK3蛋白的表达可能与肝内胆管癌细胞对二甲双胍和三氧化二砷的敏感性有关。3.二甲双胍可有效减轻三氧化二砷引起的肝细胞损伤,其可能通过抑制粒体呼吸链复合物Ⅰ,提高肝细胞内NADH/NAD+比率,进而抑制三氧化二砷诱导的细胞内ROS水平,抑制细胞凋亡性坏死。