结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在我国的发病率逐年上升,位居肿瘤相关性死亡病因的第三位。超过50%的患者在治疗前后发生肝转移,肝部转移灶的出现意味着疾病的进展以及治疗难度的加大,大多数结肠癌患者的死亡原因可以归咎于肝转移的发生。经典的解释恶性肿瘤远处转移的“种子和土壤学说”经过一百余年的不断验证与发展,得到越来越得多的研究支持,提示肿瘤远处转移的发生不仅需要肿瘤细胞本身转移潜能的增强,还需要转移靶器官提供利于肿瘤转移灶发生、进展的转移微环境。因此研究结肠癌肝转移机制也要从结肠癌细胞和肝脏微环境两发面进行探讨。结肠癌患者由于肠道易出现梗阻,导致肠道内微生物过度繁殖、菌群失调、内毒素(脂多糖,LPS)产生增多,LPS通过受损的肠道粘膜吸收进入血液引起临床上常见的内毒素血症。LPS不仅可以诱导毒发应的发生,还对肿瘤的进展、侵袭、转移有重要的影响。我们推测LPS在结肠癌肝转移的发生中扮演重要角色,既可以作用于转移肿瘤细胞,又可以诱导产生适于肿瘤细胞生存的转移局部微环境。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/趋化因子受体4(CXCR4)生物趋化轴已经被证实在肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的局部侵袭和远处转移中发挥重要作用。靶器官合成分泌SDF-1分子,吸引表达有CXCR4受体的肿瘤细胞向其趋化,类似于免疫细胞的“归巢”。已有研究证实结肠癌肝转移灶CXCR4的表达水平远高于原发灶和血液中的水平。本课题欲探讨LPS是否可以诱导肝脏组织产生,刺激结肠癌细胞表达CXCR4,从而激活SDF-1/CXCR4趋化轴参与结肠癌肝转移的发生。上皮间质转化(EMT)在胚胎发育中必不可少,能够使上皮来源细胞获得间质细胞的表型从而利于胚胎细胞的迁移从而发育成不同的器官组织。近来研究发现EMT也参与了恶性肿瘤的侵袭、转移,肿瘤细胞借此获得了更强的运动能力和在靶器官存活增殖的能力。本课题中我们将进一步探讨EMT是否作为LPS促进结肠癌肝转移的机制以及与肿瘤细胞CXCR4分子表达情况的相关性。基于上述背景,本课题分三个部分展开研究:第一部分动物体内观察脂多糖对结肠癌肝转移的影响;第二部分体外实验观察脂多糖对结肠癌细胞侵袭潜力的影响;第三部分探讨结肠癌患者肿瘤CXCR4表达情况与临床预后的相关性。第一部分动物体内观察脂多糖对结肠癌肝转移的影响本课题第一部分,我们构建Balb/c小鼠经脾结肠癌肝转移模型,小鼠腹腔注射LPS模拟体内水平的升高的LPS对肝脏的影响,并对经脾注射的C26细胞进行LPS预处理,通过对各处理组肝脏表面转移灶进行计数来判断LPS对结肠癌肝转移的影响,结果发现LPS同时处理小鼠和肿瘤细胞的实验组动物转移灶数量最多,LPS单独处理小鼠或肿瘤细胞的实验组动物转移灶数目次之,对照组动物肝部转移灶最少。统计各组实验动物的生存期并制作生存曲线,显示生存期的长短与肝部转移灶的数目呈负相关。以上结果提示LPS促进了结肠癌肝转移的发生并缩短了实验小鼠生存期,并且这一影响是通过对肿瘤细胞和肝脏转移微环境两方面作用完成的。接着,我们研究了LPS腹腔注射对小鼠肝脏SDF-1α表达的影响,ELISA结果显示血液中SDF-1α水平升高,Western-blot显示肝脏组织中SDF-1α蛋白含量增多,提示LPS诱导了SDF-1α的表达,SDF-1/CXCR4趋化轴的激活是LPS促进结肠癌肝转移的生物学机制。第二部分体外实验观察脂多糖对结肠癌细胞侵袭潜力的影响首先为了探讨LPS对结肠癌细胞运动能力的影响,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验证实LPS处理可以增强结肠癌细胞的迁移、侵袭能力,并且CXCR4抑制剂AMD3100处理细胞可以抑制LPS的这一作用,提示CXCR4是参与其中的重要分子。接下来,研究了LPS对结肠癌细胞CXCR4表达的影响,real time RT-PCR、Western-blot和细胞免疫荧光实验的结果分别从转录、蛋白合成水平证明了CXCR4在LPS处理细胞后表达升高。最后,用real time RT-PCR检测了与肿瘤转移密切相关的EMT相关基因的表达,结果显示Vimentin、Snail的表达上调、E-cadherin的表达下调,Western-blot和细胞免疫荧光实验的实验结果与RT-PCR结果相一致。这部分结果初步解释了LPS促进结肠癌肝转移的机制。第三部分探讨结肠癌患者肿瘤CXCR4表达情况与临床预后的相关性本部分收集、统计了80例结肠癌患者手术病理标本及其临床资料,通过免疫组织化学染色的方法判断肿瘤CXCR4的表达情况,并按照一定标准将所有病例分为高表达组(44例)和低表达组(36例),统计CXCR4表达情况与病例临床资料的相关性,结果显示,CXCR4的高表达与淋巴结转移及远处转移的发生相关,而与患者的年龄、性别、病灶部位无关。生存曲线还发现CXCR4高表达组患者术后生存时间明显短于低表达组,有统计学差异。综上所述,我们可以得出以下结论:1、LPS促进结肠癌肝转移的发生,这一作用是对肿瘤细胞和肝脏转移微环境两方面作用完成的。2、SDF-1α/CXCR4趋化轴及EMT参与了LPS促进结肠癌肝转移的过程。3、结肠癌CXCR4的高表达是患者预后不良的危险因素。