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背景及目的:KRAS是一类与GTP/GDP结合并具有GTP水解酶活性的小G蛋白,它通过与GTP的结合而激活多种下游信号通路,如MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路。KRAS基因也是实体瘤中最常见的异常激活的突变致癌基因,大约有95%的胰腺癌和25%的非小细胞肺癌患者有KRAS突变。目前针对KRAS突变肿瘤的治疗策略主要有直接靶向抑制突变的KRAS,作用于KRAS下游信号通路,作用于合成致死位点,免疫治疗等,但由于KRAS本身的结构特点,KRAS难以被直接靶向抑制;而作用于KRAS下游信号通路则会补偿性激活其它信号通路而使肿瘤耐药;又因为KRAS突变的肿瘤细胞遗传背景复杂,大规模的基因筛选受限,导致合成致死治疗KRAS突变肿瘤的发展缓慢;另外,免疫治疗对KRAS突变的晚期肿瘤治疗效果有限等原因,需要我们迫切的找到一种能够有效抑制KRAS突变肿瘤的治疗策略。研究表明,KRAS突变的肿瘤细胞分为依赖于KRAS而存活的KRAS依赖性肿瘤细胞和不依赖于KRAS而存活的KRAS非依赖性肿瘤细胞,直接靶向KRAS对于KRAS依赖性的肿瘤有着较好的治疗效果,目前正处于临床实验阶段;而KRAS非依赖性肿瘤的治疗仍然面临巨大挑战。因此,需要我们对KRAS非依赖性肿瘤的遗传特征进行探索,深入分析这两类肿瘤遗传特征的不同及导致这种差异性的原因,从而为KRAS非依赖性肿瘤的治疗提供理论依据。由于KRAS非依赖性肿瘤中还含有其它基因的突变,可能不依赖于KRAS而存活,再加上KRAS自身的特点而难以直接抑制,而抑制其单一的下游信号通路中的关键分子则将诱发其他信号通路的反馈激活从而导致肿瘤耐药或复发,鉴于此,利用中药单体具有多靶点的特征进行联合用药抗KRAS非依赖性肿瘤将成为一种可能。中药有效单体毒副作用小,通常在细胞中具有多个靶点。近年来,中药有效单体因在各种类型的肿瘤细胞中均有不同程度的抗肿瘤作用而日益受到关注。双氢青蒿素是一种倍半萜内酯,研究表明双氢青蒿素具有良好的抗肿瘤作用,它可通过调控MAPK信号通路,PI3K-AKT信号通路,JAK-STAT3等信号通路从而抑制体内和体外的肿瘤和肿瘤细胞生长。鉴于双氢青蒿素被报道能同时靶向抑制KRAS下游包括MAPK、AKT等多个靶点,对肿瘤的治疗有不错的效果,本研究拟以双氢青蒿素为诱饵药,探索寻找与双氢青蒿素协同抗肿瘤的中药单体,并深入研究其作用机制。方法及结果:一.KRAS突变的肿瘤细胞对KRAS的依赖性研究1.构建KRAS-shRNA慢病毒载体,包装慢病毒,感染多种类型的肿瘤细胞去敲减KRAS基因,免疫印迹实验证实KRAS被敲减;克隆形成实验证明部分细胞如H460,HCT116等在KRAS敲减后其克隆生成不受影响,为KRAS非依赖性肿瘤细胞,另一部分细胞如H358,PANC1等则被抑制而难以形成克隆,为KRAS依赖性肿瘤细胞。2.通过COSMIC数据库分析KRAS突变肿瘤细胞的基因突变,发现KRAS非依赖性肿瘤细胞多具有PIK3CA或PTEN突变;KRAS依赖性肿瘤细胞多具有BRAF突变。二.芹菜素协同双氢青蒿素抗KRAS非依赖性肿瘤的作用研究1.以人源H460和HCT116为体外模型,利用MTT方法进行药物筛选,发现中药有效单体芹菜素能增强双氢青蒿素抗肿瘤作用。2.高内涵细胞成像实验证实芹菜素协同双氢青蒿素抑制KRAS非依赖性肿瘤细胞的增殖。3.克隆形成实验证实芹菜素和双氢青蒿素联合用药抑制KRAS非依赖性肿瘤细胞克隆集落形成。4.利用MTT方法分析发现双药联合对不同突变类型的肿瘤细胞均有不同程度的抗肿瘤效果,结合COSMIC数据库分析肿瘤细胞的基因突变,证实双药联合对含有KRAS/PIK3CA双突变肿瘤细胞的协同抑制效果最佳。三.双药联合抗KRAS非依赖性肿瘤的作用机理研究1.流式细胞术实验证实双药联合将肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期。2.蛋白质免疫印迹实验发现双药联合后P21,P27蛋白的表达上调,证实双药联合引起细胞周期G0/G1期阻滞。3.磷酸激酶芯片实验发现双药联合导致ERK,HSP27,STAT3等蛋白的磷酸化被显著抑制,提示ERK,HSP27,STAT3等可能在双药联合抗KRAS突变肿瘤中发挥关键作用。4.蛋白质免疫印迹实验证实双药联合后ERK,HSP27和STAT3的磷酸化被显著抑制。5.利用MTT实验和蛋白质免疫印迹实验证明增强HSP27的功能后,挽救了由双药联合所引起的肿瘤细胞生长抑制,而抑制HSP27或STAT3的功能,则增强由芹菜素单药或双氢青蒿素单药所引起的肿瘤细胞生长抑制。四.双药联合抑制体内肿瘤的作用及机理研究1.体内实验证明,相对于对照组和单药处理组,双药联合能显著抑制裸鼠肿瘤的生长。2.蛋白质免疫印迹实验证明:与体外实验结果一致,体内双药联合抑制了 ERK和STAT3的磷酸化。结论及意义:本研究发现部分KRAS突变肿瘤细胞能不依赖于KRAS的存在而生长增殖,针对此类肿瘤细胞,经联合用药筛选发现,芹菜素和双氢青蒿素的联合使用对KRAS/PIK3CA双突变肿瘤细胞有很好的协同抑制作用,体内的实验结果也证实了这一点,进一步分子机制研究表明双药联合是通过抑制ERK,HSP27,STAT3等的磷酸化而发挥抗肿瘤作用,并且在体内与体外得到一致验证。本研究的开展,对于含KRAS及PIK3CA突变肿瘤提出了利用中药有效单体芹菜素和双氢青蒿素联合用药多靶点协同抗肿瘤的治疗策略,为KRAS突变肿瘤的治疗提供了理论依据。