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目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白诱导上皮细胞间质化转变和肝细胞肝癌进程的机制及SIP1在其中发挥的作用。方法:1、pHBx质粒转染SMMC-7721细胞与HepG2细胞后,运用Transwell实验观察细胞迁移能力变化,检测细胞中SIP1及EMT相关蛋白的表达情况。2、构建稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-X,运用Trasnwell实验观察细胞迁移能力变化,运用Western-blot、qPCR及免疫荧光技术检测细胞SIP1及EMT相关蛋白的表达情况。3、siHBx质粒转染HepG-X细胞,或者在表达HBx的HepG2细胞中敲减SIP1,用Western-blot验证HBx及SIP1敲减情况并检测相关蛋白的表达水平。4、用质粒pRL-PK与pGL3-Basic或pGL3-E-cadherin-luc共转染由HBx处理的肝癌细胞系,酶标仪检测相对荧光素活性。5、HBX转染HepG2细胞12、24、36及48h后,用q-PCR检测各时间点E-cadherin mRNA的变化,选取mRNA发生明显变化的时间作为最佳时间点,用ChIP检测该时间点的E-cadherin基因启动子与SIP1结合情况。选择以下位点进行分析:转录起始位点附近E-box区域、转录起始位点上下游远端区域。6、用质粒pGL3-E-cadherin-luc或者pGL3-E-cad-MUT-luc与pRL-PK共转染由HBx及shSIP1处理的HepG2细胞,酶标仪检测相对荧光素酶活性。7、选取TSA的浓度范围(依推荐浓度为中间值),用不同浓度的TSA分别作用HepG2细胞及HepG2-X细胞72h,每24h更换一次新鲜液体,WB检测各组细胞蛋白表达水平确定TSA最佳作用浓度;采用最佳浓度TSA刺激HepG2细胞及HepG2-X并在72h后检测E-cadherin及HDAC1蛋白表达水平。8、用质粒pGL3-E-cadherin-luc与p RL-PK共转染由TSA以及SIP1质粒或者shSIP1处理的稳定表达HBx的HepG2细胞,酶标仪检测E-cadherin启动子的相对荧光素酶活性。9、HepG2细胞分别转染pcDNA3.1+shControl/pHBX+shControl/pHBX+shSIP1,用ChIP检测E-cadherin基因启动子区结合水平及组蛋白修饰事件。10、通过Co-IP检测HBx、SIP1及HDAC1在肝癌细胞内的相互作用,免疫荧光技术检测HBx及SIP1在细胞共同定位。11、运用CCK8实验检测HBx过表达及SIP1敲减后对肝癌细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化。12、动物实验:将HepG2和两组HepG2-X分别转染shControl/shControl/shSIP1并扩大培养,通过腋下分别注入三组4-6周龄裸鼠(荷瘤鼠)体内,约四周时间后观察肿瘤大小并通过组织蛋白提取检测相应蛋白的表达水平;同时取部分新鲜肿瘤组织切成小块状种植于三组6-8周龄裸鼠(种瘤鼠)肝脏上造成肝脏原位肿瘤模型,待原位肝脏肿瘤模型小鼠自然死亡后,取各小鼠内脏器官做HE染色,观察肿瘤转移情况。结果:1、HBx使肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞迁移能力提高,细胞内蛋白和mRNA发生变化:上皮化标志物E-cadherin减少,SIP1增加及间质化标志物Vimintin增加。2、稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-X构建成功,Transwell实验结果示该细胞迁移能力提高,细胞内SIP1蛋白和mRNA增加,E-cadherin减少;而敲减HepG-X细胞内HBx后,细胞内SIP1蛋白减少,而E-cadherin表达量增加。3、在表达HBx的HepG2细胞中敲减SIP1后,细胞的迁移能力下降,Western-blot及免疫荧光结果示E-cadherin增加而Vimintin减少。4、HBx对E-cadherin启动子活性有明显抑制作用,TSA、SIP1过表达及敲减均影响HBV X对E-cadherin启动子活性的作用。5、ChIP结果显示:过表达HBx的HepG2细胞中SIP1与E-cadherin基因结合水平发生变化,在转录起始位点附近区域呈明显升高(但远离转录起始位点的远端上下游区域则无明显变化)。同时,过表达HBx可以增加HDAC1与E-cadherin基因启动子结合水平,而SIP1敲减则降低这种结合。6、HBx导致的E-cadherin表达量减少可在一定程度上被TSA恢复。7、Co-IP显示HBx、SIP1及HDAC1在肝癌细胞内具有相互作用,免疫荧光技术的结果表明三者在细胞核内有共同定位区域。8、HBx促进肝癌细胞增殖,抑制凋亡,而敲减SIP1则达到相反效果;过表达HBx促进人肝癌细胞周期由G0/G1期向S期过渡,而敲减SIP1使细胞阻滞于G0/G1期。9、皮下成瘤小鼠模型造模成功,HepG2-X+shControl组裸鼠皮下瘤体积总体大于HepG2对照组和及敲减SIP1的HepG2-X组;肝脏肿瘤原位移植模型造模成功,HepG2-X+shControl组裸鼠可见明显的膈肌转移,以及更为明显的肝内肿瘤转移,而其他两组则未见肝外明显转移,肝内肿瘤转移也相对范围更小。结论乙型肝炎病毒蛋白表观激活SIP1诱导上皮细胞间质化转变,并促进肝细胞肝癌的进程。