心功能不全在全世界的发病率与死亡率越来越高。心肌细胞是具有有限再生能力的终末分化细胞,心肌细胞大量丢失可引起心功能障碍,进而导致心功能不全。有研究报道,自噬调节的细胞死亡是心功能不全中细胞死亡的最常见形式。而心功能不全中自噬水平降低的机制尚不十分清楚。以往大量研究发现,在多种心血管疾病患者血清中β₁肾上腺素受体自身抗体（β₁-adrenergic receptor autoantibody,β₁-AA）的阳性率比正常人高。我们前期研究发现,β₁-AA诱导心肌自噬水平降低,并且这种自噬抑制参与β₁-AA诱导的心肌细胞死亡乃至心功能不全。进一步研究发现,β₁-AA通过激活β₁-AR-cAMP进而活化蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）可降低心肌自噬水平,然而拮抗PKA并不能完全逆转β₁-AA诱导的心肌自噬水平下降,提示还有其他因素参与β₁-AA诱导的心肌自噬抑制。Epac1是cAMP新近发现的另一下游信号通路,那么Epac1是否参与β₁-AA诱导的自噬水平降低及其相关机制目前尚不清楚。因此,本研究采用β₁-AR-ECII抗原肽段,主动免疫8周龄雄性SD大鼠2 w,4 w,6 w,8 w,用SA-ELISA法检测大鼠血清中β₁-AA的OD值以鉴定大鼠模型是否建立成功。用亲和层析法提纯大鼠血清中的β₁-AA,用于离体实验。本研究运用ELISA检测心肌组织cAMP含量,Western Blot检测心肌组织PKA活性,运用Western blot及RT-PCR方法检测自噬相关基因LC3、Beclin1、P62的蛋白和mRNA表达水平。利用亲和层析法纯化的β₁-AA对H9c2心肌细胞进行处理,观察β₁-AA对cAMP,p-PKA表达的影响及自噬水平的变化,进一步给予PKA抑制剂H89观察自噬的变化情况。结果发现,β₁-AA长期刺激引起心肌组织cAMP,p-PKA表达显著增加,自噬水平明显下降,而抑制PKA可明显拮抗β₁-AA诱导的心肌自噬水平降低,然而,抑制PKA并不能完全逆转β₁-AA诱导的心肌自噬降低。因此,我们进一步采用Western blot检测主动免疫大鼠心肌组织和β₁-AA刺激H9c2心肌细胞的Epac1表达情况,结果显示,β₁-AA诱导心肌Epac1表达增加。采用Epac1抑制剂ESI-09处理H9c2心肌细胞,观察抑制Epac1的表达对心肌细胞自噬的影响,结果发现抑制Epac1可明显改善β₁-AA诱导的心肌自噬水平下降。接下来,我们重点探究β₁-AA诱导心肌Epac1表达增加的可能机制。β₁-AA是针对β₁-AR细胞外第二环产生的自身抗体,可特异性激活β₁-AR发挥效应,慢性长期β₁-AR刺激可引发左心室扩张,心功能不全。另有研究表明,β₂-AR可以与β₁-AR形成异源二聚体,增强β₁-AR的生物学效应。我们课题组已有研究发现,β₂-AR不与β₁-AA直接结合,但可以增强β₁-AA与β₁-AR结合引起的心肌成纤维细胞增殖。因此,我们推测β₁-AR和β₂-AR可能都参与β₁-AA诱导的心肌细胞Epac1表达上调进而抑制心肌细胞自噬。为了探讨β₁-AR和β₂-AR在β₁-AA导致心肌Epac1表达增加中的作用,我们选取β₁-AR KO鼠和β₂-AR KO鼠,用β₁-AR-ECII抗原肽段建立主免模型,检测心肌组织Epac1的表达及自噬的变化情况。结果显示,β₁-AR和β₂-AR均参与β₁-AA诱导的心肌组织Epac1表达增加及自噬水平下降。进一步,我们试图探讨β₂-AR如何影响β₁-AA诱导的Epac1表达增加。众所周知,与β₁-AR只偶联Gs蛋白不同,β₂-AR可以偶联Gs和Gi两种蛋白。有研究表明,过表达β₂-AR可以显著抑制β₁-AR的功能损伤,使用β₂-AR反向激动剂ICI 118551偏向激活Gi信号通路也可减轻这种损害,提示β₂-AR/Gi信号通路在β₁-AR的功能发挥过程中起着重要作用。为了探讨β₂-AR/Gi信号通路在β₁-AA诱导的心肌细胞Epac1表达增加中的作用。我们选择ICI 118551预处理H9c2心肌细胞,再加β₁-AA处理,结果显示,ICI 118551明显逆转β₁-AA引起的心肌细胞Epac1表达增加,自噬水平降低及细胞存活率降低,提示β₁-AA通过抑制β₂-AR/Gi信号通路导致心肌细胞Epac1表达上调。第一部分Epac1参与β₁-AA诱导的心肌自噬水平降低目的:本研究采用β₁-AR-ECII抗原肽段主动免疫SD大鼠建立模型,同时用血清中提纯的β₁-AA作用于H9c2心肌细胞,探讨Epac1是否参与β₁-AA诱导的心肌自噬水平降低。方法:（1）使用β₁-AR细胞外第二环肽段作为抗原肽段去免疫8周龄的SD大鼠,分别在主免2 w,4 w,6 w,8 w,采用ELISA检测血清中β₁-AA的OD值,以检测模型是否建立成功;（2）用亲和层析法提纯血清中的β₁-AA,并用BCA法检测其浓度,用于细胞实验;（3）采用ELISA检测β₁-AA主免大鼠心脏组织2 w,4 w,8 w及β₁-AA作用于心肌细胞12 h,24 h,36 h cAMP的浓度变化情况;（4）Western blot检测β₁-AA作用不同时间心肌组织p-PKA、Epac1蛋白的表达,Western blot和RT-PCR检测自噬相关蛋白和基因的表达。结果:（1）β₁-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠血清中β₁-AA的OD值随着免疫时间延长显著升高。（2）β₁-AA可以引起心肌组织及H9c2心肌细胞cAMP含量累积、PKA活性增加。（3）β₁-AA诱导心肌组织及H9c2心肌细胞自噬水平显著降低。（4）抑制PKA可以部分逆转β₁-AA诱导的心肌自噬水平明显下降。（5）Epac1参与β₁-AA诱导的心肌自噬降低。（6）Epac1可能通过促进IP3表达参与β₁-AA诱导的心肌自噬水平降低。结论:β₁-AA通过cAMP-PKA/Epac1诱导心肌自噬水平下降,Epac1促进IP3表达抑制心肌自噬水平。第二部分β₁-AR和β₂-AR参与β₁-AA诱导的心肌细胞Epac1表达增加目的:本研究采用β₁-AR-ECII抗原肽段主动免疫C57BL/6小鼠,β₁-AR KO鼠,β₂-AR KO鼠建立模型,同时用β₁-AA作用于H9c2心肌细胞,研究β₁-AA促进心肌细胞Epac1表达升高的受体机制。方法:（1）采用琼脂糖凝胶电泳检测基因鼠类型;（2）使用β₁-AR细胞外第二环肽段作为主动免疫的抗原肽段去分别免疫C57BL/6小鼠、β₁-AR KO鼠、β₂-AR KO鼠各4周,采用ELISA检测血清中β₁-AA的OD值,以检测模型是否建立成功;（3）Western blot和RT-PCR检测β₁-AR KO鼠、β₂-AR KO鼠心肌组织及atenolol和ICI 118551预处理,再加β₁-AA干预H9c2心肌细胞,Epac1及自噬相关蛋白和基因表达;（4）采用免疫组化检测心肌组织Epac1的原位表达情况;（5）使用CCK-8进行检测atenolol和ICI 118551预处理后,再加β₁-AA刺激H9c2心肌细胞对存活率的影响。结果:（1）β₁-AR KO鼠和β₂-AR KO鼠的基因型鉴定。（2）β₁-AR-ECII主动免疫小鼠模型建立。（3）β₁-AR参与β₁-AA诱导的心肌组织Epac1表达增加及自噬水平下降。（4）β₁-AR参与β₁-AA诱导的H9c2心肌细胞Epac1表达增加、自噬水平降低及存活率降低。（5）β₂-AR参与β₁-AA所致心肌组织Epac1表达增加及自噬水平降低。（6）β₂-AR/Gi信号通路拮抗β₁-AA诱导的H9c2心肌细胞Epac1表达增加、自噬水平降低及存活率降低。结论:β₁-AR和β₂-AR均参与β₁-AA引起的心肌组织Epac1表达增加,进而诱导心肌自噬水平下降及存活率降低。