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目的：构建PGEX-4T-3/Myo5a原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,并对该重组蛋白进行纯化。
方法：采用多聚酶链式反应(PCR)扩增出四个MyoSa基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠杆菌BL21,感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷酶)诱导重组蛋白表达。亲和层析法纯化PGEX-4T-3/Myo5a重组蛋白。采用SDS-PAGE电泳、Western blotting分析证实蛋白表达的特异性。
结果：经限制性酶切、PCR和测序鉴定证实原核重组载体PGEX-4T-3/Myo5a构建成功,经IPTG诱导重组蛋白表达后,SDS-PAGE电泳证明表达产物相对分子量为30kD左右,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,通过亲和层析法对蛋白进行了纯化,获得了PGEX-4T-3/Myo5a融合蛋白的纯品。
结论：构建了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达了PGEX-4T-3/Myo5a融合蛋白。亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究Myo5a的生物学功能奠定了基础。