肺癌是世界性的健康问题,在中国,肺癌的发病率和死亡率长年都居于第一,对中国人群的健康和生命造成了巨大的威胁,造成了巨大的社会经济负担。非小细胞肺癌约占肺癌总数的85%左右,在非小细胞肺癌个性化治疗方面,目前对于非小细胞肺癌的研究已深入到基因水平,相关的分子标志物比如表皮生长因子受体、肿瘤蛋白p53等的表达水平可能直接影响临床医生对于治疗方案的选择,随着非小细胞肺癌治疗方案的细化以及分子靶向治疗的不断开展,非小细胞肺癌诊断和预后相关的新型肿瘤分子标志物仍需不断更新,以满足临床评估非小细胞肺癌的诊断和预后的需要。LncRNA大小超过200nt,缺乏蛋白质编码能力。目前已经确定了 14,880个人类IncRNAs,LncRNAs是聚合物Ⅱ(pol Ⅱ)的产物,绝大多数均被封闭,聚腺苷酸化和频繁剪接。转录谱分析研究逐渐揭示了 IncRNAs在人类的各类疾病中的作用。在癌症领域,与相应的正常组织相比,IncRNA表达在肿瘤细胞和组织中出现了显著的失调,并广泛参与了肿瘤细胞的恶性转化、谱系特异性改变、基因拷贝数变化和表观遗传修饰等生物学过程。研究发现其对肿瘤细胞株的增殖和凋亡,以及细胞周期和细胞代谢,细胞侵袭转移等一系列行为产生调控。人母系表达基因3(maternallyexpressedgene 3,MEG3),是重要的癌症相关IncRNA之一,也被称为GTL2,最初被确定在远端小鼠12号染色体上,MEG3定位于人类染色体14q32,长度约1.6 kb,产生各种替代剪接的转录本。与它的小鼠同系物类似,MEG3的表达和调控对胚胎形成以及生长发育至关重要。在人垂体肿瘤、宫颈癌、尿路上皮癌、前列腺癌等类型的肿瘤中纷纷检测到MEG3的表达缺失,高度提示MEG3可能作为抑癌基因在肿瘤的各个生物学过程中发挥作用。在对不同类型的肿瘤的研究中发现,MEG3多数发挥其抑癌作用,其高表达可诱导肝癌细胞生长停滞,促进肝癌细胞的凋亡,还可抑制乳腺癌细胞的过度增殖,降低其恶性程度,在甲状腺癌中也发现MEG3的表达缺失与其恶性转化有关。在MEG3及NSCLC相关的基础研究中发现,NSCLC细胞的MEG3启动子区常出现异常甲基化,造成MEG3在NSCLC中表达抑制或者缺失,而MEG3异常表达可以对p53、MDM2、CDF15、pRb等关键细胞因子产生影响,继而造成NSCLC细胞的增殖、凋亡以及侵袭转移等生物学过程失调控。另外,MEG3还被认为与NSCLC对铂类药物的敏感性有关。有些对临床组织标本的研究也证实MEG3在NSCLC组织中表达多有降低乃至缺失,而其低表达可能是NSCLC患者的不良预后因素。依据MEG3对p53等关键基因的影响以及其在NSCLC中表达下调的现象,研究者们认为MEG3可能作为一种肿瘤抑制剂,通过p53相关的分子途径,影响NSCLC细胞的生物学行为,从而影响NSCLC患者的预后。但是到目前为止,MEG3下调与NSCLC患者的不良预后有关的报道还有所不足,机制还需进一步论证,MEG3表达的异常对非小细胞肺癌患者的临床意义仍不清楚,还有待进一步探究。本文旨在对MEG3与非小细胞肺癌患者预后的相关性及机制进行了系统的研究论述;第一部分:选取GEO数据库中临床病理参数,进行研究分析,发现非小细胞肺癌中长链非编码RNA-MEG3低表达提示预后不良;第二部分:基础实验,揭示MEG3在非小细胞肺癌中的表达情况及其生物学行为,从而进一步论证分析MEG作为抑癌基因机制;第三部分:对长链非编码RNA-MEG3与肿瘤的国内外最新研究进展进行综述。从临床数据、基础研究、研究进展三方面,对MEG3进行综合研究,探讨非小细胞肺癌中MEG3表达与预后的关系,以期为癌症诊断,治疗和预后寻找到一个潜在靶点。一、非小细胞肺癌中长链非编码RNA-MEG3低表达提示预后不良:GEO数据研究分析1.研究方法本研究从 Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(Affymetrix U133 Plus 2.0 platform)中获得7个总计1144名患者的子数据集。以SPSS 22.0软件使用卡方检验测试MEG3的表达和年龄,吸烟指数,性别,组织学,分期,吸烟状况,种族和辅助治疗等其他变量之间的关联。以Kaplan-Meier生存分析探索MEG3表达与总生存期/无进展生存期之间的关联。对影响患者OS和PFS的临床病理数据进行单变量Cox比例危险回归分析,在单变量Cox回归分析中对P<0.05的变量进行多元回归分析;对年龄,性别,组织学,分期,种族,吸烟状况和辅助化疗等变量进行亚组分析。以STATA 12.0软件对7组数据集进行meta分析以进一步探究MEG3表达对患者预后的影响,应用随机效应模型对风险比进行了估计,以风险比和95%置信区间(95%confidence interval,95%CI)绘制森林图,并将每个数据集对汇总结果的影响进行了敏感性分析,最后以Egger测试进行出版偏倚评估。以P<0.05为差异具有统计学意义,详细分析MEG3在各数据集中及汇总后与NSCLC患者OS/PFS的相关性。2.研究结果:GEO数据库中患者MEG3表达与患者临床病理参数的相关研究中发现,MEG3的差异表达与患者临床分期(GSE31210OS和GSE31210PFS),组织学(GSE290130S和GSE29013PFS)和性别(GSE29013PFS)有关。进一步分析MEG3与患者OS/PFS的相关性后发现,在 GSE3141(P= 0.039),GSE30219(P= 0.008)中患者的 OS和GSE30219(P= 0.048)中患者PFS与MEG3的表达水平相关。MEG3低表达与GSE31210 数据库患者 OS 缩短有一定关联(P= 0.050)。在 GSE31410S、GSE302190S、GSE31210OS、GSE377450S、GSE500810S、GSE29013PFS、GSE30219PFS、GSE31210PFS和GSE37745PFS中,MEG3高表达组NSCLC患者的五年生存率较MEG3低表达组均明显提高。MEG3是GSE30219中患者PFS的独立预后因素(HR 0.666,95%Cl 0.458-0.969,P= 0.033)。在 Oncomine 数据库中分别比较了 MEG3在肺腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌组织中与非肿瘤组织中MEG3的差异表达,汇总结果提示MEG3在非小细胞肺癌患者中低表达(中位数=4346.0,P<0.001)。GEO数据汇总结果提示:MEG3低表达是非小细胞肺癌预后不良的因素(HR =0.77,95%CI0.63-0.95)。尤其在年轻患者(≤60岁)中MEG3低表达与不良预后的关系十分显著(HR0.602,95%CI 0.417-0.867,P= 0.007)。3.研究结论:MEG3的表达受到患者临床分期、组织学以及性别等因素的影响,非小细胞肺癌患者中常出现MEG3的表达抑制或者缺失,患者的总生存期或无进展生存期缩短与MEG3下调密切相关,尤其在年轻患者(≤60岁)中MEG3低表达与不良预后的关系十分显著,MEG3可以作为影响非小细胞肺癌患者预后的一个新型生物标记物。考虑到回顾性研究的弱点,有必要进行前瞻性研究进一步论证。需要更深入的探索来阐明MEG3高表达在肿瘤抑制中的的作用机制。二、MEG3在非小细胞肺癌中的表达及其生物学行为研究1.研究方法:在我们的前期研究中利用多个GEO数据集证实MEG3在肺癌中下调,并与不良预后相关,但机制不明。故后期,依托于山东省立医院肿瘤组织数据库,我们通过数据管理系统,从山东省立医院2011-2012年入院行肺癌切除术,并保存有冰冻组织的患者中随机选取了 40例患者,均为非小细胞肺癌患者,并获得其冰冻肿瘤组织及匹配正常组织;同时选取人肺腺癌细胞系A549(购自于美国模式培养物集存库);我们利用肺癌肿瘤组织及匹配正常组织,通过实时定量PCR探索MEG3在肺癌及正常组织中的表达;质粒转染,MEG3在A549细胞过表达,siRINIA转染敲除A549细胞中的MEG3,然后SRB法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,溴化乙锭(PI)法检测细胞周期,划痕实验检测迁移,免疫印迹杂交实验(Western blotting)检测MEG3对部分EMT指标的影响;从而探索MEG3在非小细胞肺癌中的生物学功能。2.研究结果通过检测肺癌组织及匹配正常组织中MEG3的相对表达量,在大部分患者肿瘤组织中MEG3的表达明显低于正常组织(p<0.0001);通过SRB实验及Annexin V-FITC/PI法检测肺癌细胞增殖及凋亡,证实过表达MEG3能够明显抑制A549细胞增殖,促进其凋亡,而敲除MEG3能在一定程度上促进A549细胞增殖,但对凋亡没有产生影响;过表达MEG3引起了明显的G0/G1期细胞阻滞(p=O.02),但对G2/M期没有明显影响;通过划痕实验证实,在过表达MEG3后,细胞的迁移作用明显被抑制;通过实时定量PCR发现MEG3上调后上皮性指标CDH1出现了明显的上调,但间质性指标CDH2及VIM出现了明显的下调;SNAI1、SNAI2作为上皮间质转化的转录因子出现了明显的下调;而TGFB1下调最为明显。但血管生成指标VEGFA、VEGFB、KDR等变化不明显,MMP3、MMP9也出现了一定程度的下调;Western blotting实验显示当敲除MEG3后,PDGFRA、PDGFRB出现了明显的上调,Snail1、Snail2、CDH2及KDR15等EMT相关指标出现明显上调,进一步证实MEG3在EMT中的重要作用。3.研究结论本研究通过实时定量PCR检测MEG3在肿瘤及匹配正常组织中的表达证实MEG3在NSCLC肿瘤及正常组织间存在表达差异,其在肿瘤中的表达明显低于正常组织;MEG3能够影响NSCLC细胞的周期,引起周期抑制;MEG3能够抑制增殖,促进肿瘤细胞的凋亡;MEG3在NSCLC上皮间质转化及血管生成中发挥重要作用。三、长链非编码RNA-MEG3与肿瘤我们对国内外长链非编码RNA-MEG3最新的研究进展,进行了系统的综述,包括:、MEG3的调控机制、MEG3与癌症、MEG3与非小细胞肺癌、MEG3在癌症治疗中的前景、价值及可能性。从而进一步验证总结我们前期的临床研究及实验研究结果。结论:LncRNA的功能多样,作用机制复杂,需进一步进行研究探讨;MEG3与各种癌症的临床病理学结果密切相关;MEG3的表达缺失或降低在人类癌症中十分常见,但MEG3多数情况下是一种基于RNA的肿瘤抑制因子,参与了肿瘤的病因和进展等的反应,其活性通过TP53依赖性和TP53独立过程介导;MEG3可与许多肿瘤相关基因(包括TP53,MDM2,GDF15,Rb1和TGF-β)相互作用:其在正常和不同级别癌症之间的差异表达,使MEG3可以成为评估癌症的分期和预后的生物标志物。四、全文总结通过以上GEO数据库临床病理参数研究、基础研究、综述国内外长链非编码RNA-MEG3研究进展,可以得出最终结论:长链非编码RNA-MEG3在非小细胞肺癌中低表达提示预后不良,MEG3是抑癌基因,可作为癌症诊断,治疗和评估预后的潜在靶点;同时,随着实时定量PCR,微阵列,下一代测序等的现代科研技术的进步,廉价的费用,可以在临床广泛应用,为临床诊疗和随访提供指导。