藤茶中APS的抗菌作用及其机理研究

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目的:探讨从藤茶(Ampelopsisgrossedentata)中提取得到的一单体化合物双氢杨梅树皮素(Ampelopsin,简称APS,下同)的抗菌作用及其作用机理。 方法:从急性毒性、体内、外抗菌试验和对机体免疫功能的影响等几个方面探讨APS的抗菌作用及其机理。(1)分别利用琼脂稀释法对标准金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(简称标准金葡菌,下同)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、绿脓杆菌(10104)、大肠杆菌(44102)、乙型溶血性链球菌(32210)、福氏痢疾杆菌(5101)、白色葡萄球菌、奈氏菌、白色念珠菌、枯草杆菌进行最低抑菌浓度(MIC)测定,还对标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌进行了最低杀菌浓度(MBC)测定,并与盐酸黄连素相比较;利用不同浓度APS对标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌进行体外杀菌曲线测定;采用半体内实验法,利用不同时间段的含APS兔血清对标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌进行杀菌曲线测定;将标准金葡菌连续接种于含APS的培养基中,观察其耐药性。(2)应用电子显微镜观察经APS作用前后标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌的形态学变化;利用同位素[3H]标记的胸苷(TdR)、尿苷(UR)掺入法,观察APS对细菌核酸合成的影响。(3)小鼠腹腔注射活标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌造成细菌感染模型,观察APS对感染小鼠的保护作用。(4)观察APS对小鼠免疫器官脾脏、胸腺重量和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响;利用同位素[3H]标记TdR掺入法,观察APS对刀豆蛋白(ConA)诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应的影响;进行2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的迟发型超敏反应试验(DTH)和血清溶血素含量的测定。 结果:(1)APS一次性腹腔注射给药的LD50及其可信限为1.41±0.13g/kg(P=0.95),一次性静脉注射给药的LD50及其可信限为0.483±0.06g/kg(P=0.95),一次口服的最大耐受量为5.24g/kg。(2)对标准金葡菌(ATCC25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、绿脓杆菌(10104)、大肠杆菌(44102)、乙型溶血性链球菌(32210)、福氏痢疾杆菌(5101)、白色葡萄球菌、奈氏菌、白色念珠菌、枯草杆菌的MIC分别为:0.078、0.078、1.25、0.31、2.5、1.25、0.625、2.5、5、1.25mg/ml,对标准金葡菌、MRSA、绿脓杆菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的MBC分别为:0.312、0.312、6.25、1.55、5mg/ml;体外杀菌曲线表明,APS对标准金葡菌(ATCC25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、绿脓杆菌(10104)有直接抑制作用,且与药物剂量呈正相关;给APS后的兔血清对标准金葡菌、MRSA和绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用;细菌抗药性诱导试验表明,APS不易引起标准金葡菌的耐药性。应用电镜和H3-TdR、H3-UR掺入实验,研究APS抗标准金葡菌、MRSA和绿脓杆菌的机制。结果表明,药物作用后,三种细菌的细胞壁、细胞膜均受到不同程度的损害,胞浆内容物漏出,细菌形态发生改变;对标准金葡菌、MRSA的TdR、UR合成均有明显抑制作用,对绿脓杆菌的TdR、UR合成则无明显抑制作用。(3)体内保护实验表明,对标准金葡菌、MRSA和绿脓杆菌腹腔感染小鼠,其半数有效量(ED50)及95%可信限为123.11±56.34、131.95±53.60、174.1±69.28mg/kg。(4)对机体免疫功能的影响,能明显提高小鼠的脾脏指数(P<0.01)和增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能;增强刀豆蛋白诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应,明显增加小鼠体内溶血素抗体水平和2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的小鼠耳肿胀。 结论:APS具有抗菌作用。其机理可能与损害细菌细胞壁与细胞膜及抑制细菌核酸合成和免疫增强作用有关。
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