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肝纤维化是指肝脏中弥漫性细胞外基质的沉积,特别是Ⅰ型胶原的过度产生。肝星状细胞的持续活化是肝纤维化不断进展恶化的根本原因。尽管大量的研究已经阐明了肝星状细胞由静息状态转化为活化状态过程中的细胞行为和主要信号通路(如TGF-β/Smad通路),但是对于肝星状细胞在肝纤维化过程中保持持续活化状态的深层次原因的理解还非常有限。之前的研究结果一方面并不能完全解释肝星状细胞在此阶段典型的细胞学行为,另一方面也未能为该疾病的治疗找到真正有效的治疗靶标,导致到目前为止临床上还没有一种针对纤维化病变过程本身的药物。因此,需要更加深入地研究肝星状细胞持续活化的分子机制。miR-21是一种重要的microRNA分子,在多种进行性疾病中都异常地高表达。在前期的信息学研究中,我们发现miR-21存在于多条正反馈信号通路中,这些通路对细胞关键功能有重要影响。进一步分析发现,miR-21/PDCD4/AP-1这一正反馈通路与经典的纤维化信号通路之间存在密切关联。基于这一理论预测,本论文展开深入研究,验证了该正反馈信号通路存在于肝纤维化过程中,并详细研究了其推动肝纤维化进展的机制,进一步将其作为药物治疗靶标发现了新的药物候选分子,并发展了新的生物治疗手段。首先,我们研究了 miR-21在人肝硬化样本中的表达以及分布情况,通过原位杂交实验发现miR-21在肝硬化组织中显著升高,并且集中表达于活化的肝星状细胞中;并进一步构建了硫代乙酰胺(TAA)以及四氯化碳(CC14)诱导的小鼠肝纤维化模型,验证miRNA-21的表达变化。通过检测模型小鼠中原代肝星状细胞中miR-21的变化,发现miR-21与肝星状细胞的活化以及肝纤维化的进展正相关。更为重要的是,在活化的肝星状细胞中,miR-21能够靶向降解细胞程序死亡蛋白4(PDCD4);PDCD4能够抑制转录激活蛋白1(AP-1)的活性;而AP-1转录因子能够驱动miR-21的表达。因此,miR-21,PDCD4和AP-1能够形成一个正反馈的循环通路。该循环通路能够保证AP-1在肝星状细胞中有最大的活性,并一直驱动miR-21的表达。高表达的miR-21能够靶向抑制转化生长因子(TGF-β)信号通路中抑制性蛋白Smad7,促使效应蛋白Smad2磷酸化。同时,miR-21还能够提高总Smad2蛋白的水平。另外,miRNA-21能够通过抑制PDCD4而抑制活化肝星状细胞的凋亡,因而从多方面促进肝纤维化的发展。而破坏该反馈循环通路则能抑制肝星状细胞的活化:通过antagomiR-21降低肝星状细胞中miR-21的表达,或者抑制AP-1的活性,可以显著抑制肝星状细胞活化以及肝纤维化的进展;而通过PDCD siRNA抑制PDCD4的表达则能促进肝星状细胞的活化以及促纤维化基因的表达。因此,miR-21通过形成自反馈循环通路并作用于多个靶点提高促纤维化基因的表达,在更高级别的调控网络上促进肝星状细胞的持续活化和疾病发展,是肝纤维化不断进展的主要推动力量之一。靶向miR-21/PDCD4/AP-1反馈循环通路代表了一种全新的肝纤维化治疗策略。接着,我们筛选了能够抑制miR-21/PDCD4/AP-1循环通路的小分子化合物。我们研究了小分子3’3-二吲哚甲烷(DIM)能否抑制该正反馈循环通路,并将其应用于小鼠肝纤维化模型的治疗。我们构建了 AP-1响应的Luciferase质粒并转染细胞构建AP-1响应细胞。DIM能够抑制细胞中AP-1的活性,这是通过降低AP-1家族中c-Jun和Fra-1的表达实现的。进一步,我们发现DIM能够抑制肝星状细胞系HSC-T6细胞以及原代肝星状细胞中miR-21的表达。随着miR-21在肝星状细胞中表达的下降,DIM能够抑制Smad7蛋白的降解,从而抑制Smad2蛋白的磷酸化过程,进而抑制了 TGF-β信号通路的激活以及肝星状细胞的活化。体内实验进一步表明,给予DIM治疗后,小鼠肝脏中胶原的沉积明显减少,肝脏中的TGF-β1因子的含量亦降低。而DIM处理不能降低小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)/谷草转氨酶(AST)含量,表明DIM不能抑制肝实质细胞的坏死,而是通过直接抑制促纤维化通路发挥抗纤维化的作用。因此,通过靶向miR-21/PDCD4/AP-1反馈循环通路,DIM有可能被进一步发展为潜在的抗肝纤维化药物候选物。肝纤维化治疗的另一策略是通过设计靶向肝星状细胞的药物输送载体,以更加有效地将药物输送至肝星状细胞中。肝星状细胞的最大特性之一是能够吸收贮存视黄醇,而视黄醇结合蛋白(RBP)介导了这一主动吸收过程。通过将视黄醇与阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)偶联,我们构建了一种核酸药物输送纳米颗粒。该纳米颗粒上的视黄醇基团能够使血液中的视黄醇结合蛋白在纳米颗粒表面富集,并引导该纳米颗粒靶向肝星状细胞。体外实验表明,该纳米颗粒转染肝星状细胞依赖于视黄醇结合蛋白。体内实验表明,该纳米颗粒能有效靶向肝星状细胞,输送的针对Ⅰ型胶原的反义核酸显著抑制了肝脏中胶原的沉积。因此,该靶向输送系统能够为应用核酸类药物进行肝纤维化治疗提供重要参考。