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目的肾上腺髓质素(ADM)是在嗜铬细胞瘤组织中发现的一种内源性血管活性肽,研究发现绝大多数的肿瘤细胞能够产生ADM,并且在促进肿瘤生长的过程中发挥着肿瘤生长因子的作用,在人黑素瘤组织中ADM高表达,影响黑素瘤细胞的生物学行为。RNA干扰技术可以对基因进行沉默,能够探讨ADM基因与黑素瘤发生、发展的关系,目前研究已证实siRNA沉默肾上腺髓质素基因能够将A375黑素瘤细胞阻滞在G2/M期,抑制细胞增殖、促进凋亡,降低A375黑素瘤细胞的体外侵袭能力。肿瘤细胞分泌免疫抑制分子抑制机体免疫功能,使肿瘤细胞逃避机体免疫监视,是肿瘤得以发生、发展和转移的重要机制。ADM基因的表达是否与免疫抑制分子介导的免疫逃逸有关值得进一步研究。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素-10(interleukins 10,IL-10)目前被认为是作用较强的免疫抑制分子,其通过自分泌-旁分泌等途径参与细胞的转型及逃避免疫监视,为肿瘤的发生与发展创造有利的微环境,已有实验证实在A375细胞的培养上清中可检测到VEGF、IL-10,但有关肾上腺髓质素基因影响黑素瘤细胞表达免疫抑制分子的研究国内外报道尚少见。本实验利用siRNA沉默A375黑素瘤细胞的肾上腺髓质素基因,研究其对A375细胞表达免疫抑制分子的影响,以探讨肾上腺髓质素基因在黑素瘤恶性行为中的作用,为黑素瘤的免疫治疗和基因治疗提供新思路及方向。方法:1.细胞来源:本实验采用的细胞来源于人皮肤黑素瘤细胞株A375。2.实验分组及干预:采用人黑素瘤细胞株A375,利用人工合成的ADM靶向小分子干扰RNA(small interference RAN,siRNA)转染A375细胞作为实验组,以抑制ADM基因的表达,利用人工合成的非特异序列转染A375细胞,作为阴性对照,同时以正常未转染组细胞做为空白对照。3.采用免疫细胞化学染色方法,检测各组细胞中肾上腺髓质素的表达情况。4.采用免疫细胞化学染色方法,检测各组细胞VEGF、IL-10蛋白的表达情况。5.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中VEGF、IL-10的含量。6.采用SPSS17.0统计学软件对结果进行处理,免疫细胞化学染色结果采用Wilcoxon秩和检验进行分析,计量资料数据用x±s进行统计描述,对于结果进行单因素方差分析,组间变量比较采用q检验,p<0.05为差异有统计学意义。结果:1.siRNA转染效果:在转染不同RNA序列(ADM序列、非特异序列)及未转染的干预作用下,各组A375黑素瘤细胞连续培养24h,经免疫细胞化学染色法检测,siRNA转染组ADM的表达量较弱,而阴性对照和空白对照组ADM高表达,说明siRNA可以有效的抑制ADM基因的表达。2.siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞表达VEGF的影响:在转染不同RNA序列(ADM序列、非特异序列)及未转染的干预作用下,各组A375黑素瘤细胞连续培养24h,经免疫细胞化学染色法检测,A375黑素瘤细胞可见VEGF阳性表达,阳性染色主要定位于胞浆、胞膜及胞核。以空白对照组、阴性对照组阳性表达较高,ADMsiRNA转染组VEGF的阳性信号较低;ELISA法检测各组上清液中VEGF的含量(pg/ml),可见由于转染的siRNA序列不同,A375黑素瘤细胞表达VEGF的量也不同,空白对照组VEGF的表达量为192.246±17.330,阴性对照组VEGF的表达量为187.831±14.450,ADMsiRNA转染组的表达量为96.218±10.078,转染ADMsiRNA后A375黑素瘤细胞表达VEGF的量显著低于阴性对照组和空白对照组,经方差分析,差异具有显著性(F=129.935,p<0.01),两两比较,阴性对照组与空白对照组差异无显著性(p=0.581),ADMsiRNA转染组与阴性对照组,ADMsiRNA转染组与空白对照组比较差异具有显著性(p<0.01),结果显示siRNA沉默肾上腺髓质素基因可抑制A375黑素瘤细胞对VEGF的表达。3.siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞表达IL-10的影响:在转染不同RNA序列(ADM序列、非特异序列)及未转染的干预作用下,各组A375黑素瘤细胞连续培养24h,经免疫细胞化学染色法检测,A375黑素瘤细胞可见IL-10阳性表达,阳性染色主要定位于胞浆、胞膜及胞核。以空白对照组、阴性对照组阳性表达较高,ADMsiRNA转染组IL-10的阳性信号较低;ELISA法检测各组上清液中IL-10的含量(pg/ml),可见由于转染的siRNA序列不同,A375黑素瘤细胞表达IL-10的量也不同,空白对照组IL-10的表达量为108.822±7.550,阴性对照组VEGF的表达量为103.250±4.785,ADMsiRNA转染组的表达量为37.024±5.770,转染ADMsiRNA后A375黑素瘤细胞表达IL-10的量显著低于阴性对照组和空白对照组,经方差分析,差异具有显著性(F=380.245,p<0.01),两两比较,阴性对照组与空白对照组差异无显著性(P=0.66),ADMsiRNA转染组与阴性对照组,ADMsiRNA转染组与空白对照组比较差异具有显著性(p<0.01),结果显示siRNA沉默肾上腺髓质素基因可抑制A375黑素瘤细胞对IL-10的表达。结论:1.siRNA可以有效的抑制ADM基因的表达。2.A375黑素瘤细胞可表达免疫抑制分子VEGF、IL-10。3.siRNA沉默ADM基因可下调A375黑素瘤细胞表达免疫抑制分子 VEGF、IL-10。