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刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)俗称“海水小瓜虫”,能感染大多数的海水硬骨鱼类,严重时感染会导致鱼体暴发性的死亡。近年来在中国海水养殖区刺虫(简写,下同)病频发,暴发的温度和盐度范围在不断的扩大,给养殖户及水产养殖业造成了很大损失。早年的研究认为,刺虫可以广泛感染野生和养殖海水鱼,且不具有宿主特异性。然而,随着研究的不断深入,发现不同鱼种对刺虫的耐受性并不相同。例如黄斑篮子鱼(Siganusoramin)具有天然抗刺虫能力,因为其血清中的L-氨基酸氧化酶(APP)可以直接杀灭刺虫细胞。另外,在刺虫病高暴发地区福建省,有养殖者发现,即便是在刺虫病频发季节,黄姑鱼(Nibeaalbiflora)却不会因此而大量死亡。为了进一步阐明鱼类对刺虫病害的耐受特性,探明具有天然抗虫能力鱼类的所具有的免疫机制,本研究首先比较了4种海水鲈形目鱼类抗刺虫能力的异同,随后对其中耐受力最强的黄姑鱼的免疫机制进行探究。 实验将体重(平均150g)相近的大黄鱼(Larimichthyscrocea)、花鲈(Lateolabraxjaponicus)、真鲷(Pagrusmajor)和黄姑鱼混养于同一养殖缸中,用330幼虫/g鱼的浓度的刺虫感染上述鱼类,次日分别将这四种鱼分别转移到其他干净无刺虫的水缸中,进行为期15天的养殖实验。期间每天定时检测四种鱼的存活率;定时收集包囊,对其包囊直径和包囊数量进行统计并计算感染率。 结果显示,黄姑鱼的存活率显著高于大黄鱼(P<0.01)、花鲈(P<0.05)和真鲷(P<0.05),而黄姑鱼产生包囊的平均直径(268μm)极显著小于真鲷(306μm,P<0.01)、鲈鱼(339μm,P<0.01)和大黄鱼(379μm,P<0.01)。 本次实验还检测了这4种鱼在无刺虫感染过情况下的血清凝集效价。结果显示,4种鱼的血清都能不同程度的杀死刺虫,但是黄姑鱼凝集效价显著高于大黄鱼(P<0.05)、花鲈(P<0.05)和真鲷(P<0.05)。然而四种鱼的血清在56℃加热后都失去了杀虫能力,说明鱼体抗虫因子包括一类不耐热成分,比如补体等,其含量尤以黄姑鱼最高。通过相关性分析可知,生存率/血清效价和包囊平均直径间存在显著的负相关性(r=-0.986,P=0.014)。此外,黄姑鱼的刺虫感染率最小,表明黄姑鱼的血清可以抑制刺虫细胞的发育,包囊直径越小,刺虫感染的数量越少,鱼的生存率就越高。 为了进一步探究黄姑鱼对刺虫感染的抵抗力和自愈能力,本次试验用半致死浓度(2050幼虫/g鱼)的刺虫感染黄姑鱼(40g),比较感染刺虫后不同时间点黄姑鱼摄食量、存活率、相对感染强度(RII)和相对包囊数量(RNT)的变化。结果显示,虽然黄姑鱼的摄食量在感染第1天开始显著下降,第二天停食,但从第3天开始少量摄食,并逐渐恢复正常。在刺虫包囊大量残余的养殖缸中,即便再经过十余天的继续培育,黄姑鱼也不再大量死亡,而刺虫却逐渐消失。RII值代表鱼体上刺虫滋养体的相对数值,该值分别在第3天和第6天达到峰值,RII值的第二个峰值显著小于第一个,第8天该值降为零,说明滋养体已全部消失,且未再出现。两次RNT峰值分别出现在感染后的第3天和第7天,但是第二次峰值还不到第一次峰值的十分之一,而且包囊很快消失。再通过阻动效价试验发现,无论感染组还是对照组,黄姑鱼血清和体表黏液均可以直接杀灭刺虫细胞。但当上述血清或者黏液预先经过56℃处理30min,其阻动效价显著降低接近为“0”。也预示着补体可能起到了杀灭刺虫的作用。 为了进一步验证补体的功效及其哪种激活途径发挥主要作用,本研究采用补体特异性抑制剂对黄姑鱼血清进行预处理。包括EDTA、EGTA、L-赖氨酸、酵母聚糖和肼。通过抑制相应补体激活途径活性,并结合血清效价的测定,来研究其效应机制。结果显示,添加了EDTA和肼后,黄姑鱼血清的抑动效价消失。上述两种药剂是补体三条途径的抑制剂,进一步证明黄姑鱼体起到抗虫作用的关键因子确实包括补体系统。再进一步开展补体激活途径特异性抑制试验。实验结果显示,经L-赖氨酸或EGTA的处理后,在黄姑鱼血清中仍检测到强的杀虫效价,而在含有EDTA和酵母聚糖的血清中则无法杀死刺虫。说明补体旁路途径起到了关键作用。 肝脏是鱼类最大的腺体,也是补体产生的重要场所。本实验用感染浓度为2050幼虫/g鱼的刺虫感染黄姑鱼,比较感染后不同时间点(24h、48h、72h、96h)黄姑鱼肝脏补体C3、补体旁路途经溶血(ACH50)活力及LZM、SOD等免疫酶的活性。结果显示,补体因子C3活性先下降后上升;而ACH50活性四天内一直显著性升高。LZM和SOD活性在第1天显著下降,且活性最低,中间略为回升,第4天又下降。 本实验表明黄姑鱼对刺虫具有较高的抵抗力和一定的自我修复能力。鱼体的补体系统,尤其是补体的旁路途径发挥了主要作用。