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背景:皮肤老化是人体衰老的重要标志之一,除内源性自然衰老外,外源性环境也可致人类皮肤老化的发生。其中长波紫外线(ultraviolet a,UVA)辐射是引起皮肤老化的最主要外源性因素,该过程也称为皮肤光老化。长时间的紫外线辐射不仅加速皮肤的老化进程,还可导致斑点色素沉着、毛细血管扩张、光老化性紫癜、甚至癌前病变等病理改变。目前光老化的治疗方法主要包括维甲酸外用、肉毒素注射、软组织填充、激光治疗等,皮肤状态可得到一定改善,但由于光老化机制不清,这些治疗方法很难从根本上达到延缓皮肤老化的作用。Pc G(Polycomb group)复合体是一种染色质修饰蛋白,控制个体正确的发育模式。Pc G不仅与细胞分化增殖和肿瘤发生等过程密切相关,并且参与机体和细胞衰老的表观调控。在Pc G家族复合物中,多梳复合体2(polycomb repressivecomplex2,PRC2)的亚基E(z)/EZH2起着核心作用,参与染色质结构的形成、基因表达调控以及DNA损伤等多种分子机制过程。EZH2具有组蛋白甲基转移酶的活性,可催化组蛋白H3和H4的N端赖氨酸或者精氨酸残基发生甲基化,从而通过调节组蛋白甲基化修饰过程表观调控细胞的增殖、分化和肿瘤发生。然而针对光老化的表观遗传学研究目前鲜见报道,我们课题组前期发现皮肤光老化过程中Pc G家族复合物可能参与了透明质酸的合成调控,因而Pc G复合物可能是皮肤光老化过程中的一个重要的表观遗传学调控分子。目的:探讨UVA辐射诱导成纤维细胞损伤衰老过程中Pc G蛋白复合体对透明质酸合成代谢及透明质酸参与的分子信号通路相关靶基因的调控作用,为进一步阐明皮肤光老化过程中Pc G家族的表观遗传调控机制提供坚实理论依据。实验方法:本实验以人皮肤成纤维(human skin fibroblast,HSF)细胞作为研究对象,利用长波紫外线辐射人皮肤成纤维细胞构建紫外线辐射诱导成纤维细胞损伤模型。1.探究UVA辐射对成纤维细胞表型的影响以及EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126对UVA辐射诱导成纤维细胞表型改变的作用:我们采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色观察了不同剂量UVA辐射对成纤维细胞衰老的影响及EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126对UVA辐射介导成纤维细胞衰老改变的影响;采用细胞增殖实验(cell-counting kit 8,CCK8)检测了不同剂量UVA辐射对成纤维细胞增殖活性的影响及GSK126对UVA辐射介导成纤维细胞增殖活性改变的影响;采用细胞凋亡-Hoechst染色及流式细胞技术检测了GSK126对UVA辐射介导成纤维细胞凋亡改变的影响;采用红细胞颗粒排阻实验观察不同剂量UVA辐射对成纤维细胞周围透明质酸含量的影响及GSK126对UVA辐射介导成纤维细胞周围透明质酸含量改变的影响。2.UVA辐射诱导成纤维细胞衰老及GSK126抗成纤维细胞衰老机理初步探讨—相关分子转录水平的变化:我们采用实时定量多聚酶链反应(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测不同剂量UVA辐射对Pc G关键基因、HA合成代谢相关基因及HA参加的信号通路分子相关基因表达的影响;并检测了GSK126对UVA辐射诱导成纤维细胞衰老模型中以上相关基因的表达变化。3.UVA辐射诱导成纤维细胞衰老及GSK126抗成纤维细胞衰老机理初步探讨—相关分子翻译水平的变化:我们采用SDS-PAGE凝胶电泳检测了UVA辐射及GSK126对Pc G家族关键亚基EZH2、HA合成系统及组蛋白H3K27me3的蛋白表达的影响。实验结果:1.不同剂量UVA辐射对成纤维细胞表型的影响及EZH2甲基转移酶抑制GSK126对UVA辐射诱导成纤维细胞表型变化的影响:β-半乳糖苷酶染色结果显示与对照组相比5J/cm2、10J/cm2大剂量UVA辐射可明显诱导成纤维细胞衰老的发生,结果具有统计学差异(P<0.05),10J/cm2UVA辐射后成纤维细胞衰老比例最高;CCK8增殖活性检测结果显示与对照组相比不同剂量UVA(2.5J/cm2、5J/cm2、10J/cm2)辐射成纤维细胞后,细胞增殖活性均逐渐下降,10J/cm2UVA辐射剂量能明显抑制成纤维细胞增殖活性,结果具有统计学差异(P<0.05);红细胞排阻实验显示与对照组相比,5J/cm2、10J/cm2UVA辐射成纤维细胞后,HSF细胞对周围红细胞产生的空间排阻作用减轻,10J/cm2 UVA辐射HSF细胞后对红细胞的空间排阻作用基本消失。β-半乳糖苷酶染色结果显示对照组(10J/cm2)相比,GSK126可明显降低UVA辐射所致成纤维细胞衰老比例,结果具有统计学差异(P<0.05);CCK8增殖活性检测结果显示与对照组(10J/cm2)相比GSK126的加入使细胞增殖活性逐渐增加,结果具有统计学差异(P<0.05);Hoeschst凋亡染色与流式结果显示与对照组(10J/cm2)相比,GSK126可显著抑制UVA所致成纤维细胞凋亡的发生,结果具有统计学差异(P<0.05);红细胞排阻实验显示与对照组相比(0J/cm2、5J/cm2、10J/cm2),GSK126可相应增强各对照成纤维细胞对红细胞外排效应。2.不同剂量UVA辐射及EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126对成纤维细胞对Pc G关键基因、HA合成代谢相关基因及HA参加的信号通路分子相关基因表达的影响:PT-PCR结果显示,与对照组相比,不同剂量UVA辐射成纤维细胞后Pc G关键基因EZH2及BMI-1、HA系统相关基因、HA参与相关信号通路相关分子基因表达均于12h出现上调改变,24h出现不同程度下降趋势,其中10J/cm2UVA辐射组多有基因改变均具有统计学意义(P<0.05),2.5J/cm2、5J/cm2剂量组部分改变具有统计学意义;EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126可促使UVA辐射所致HAS2、HAS3、CD44、P16、BMI-1基因上调进一步升高,下调UVA辐射所致MMP-1基因的升高,结果具有统计学意义(P<0.05)。3.UVA辐射及GSK126对成纤维细胞中EZH2、HAS1、HAS2、HAS3、H3K27me3蛋白表达的影响:UVA辐射成纤维细胞后,H3K27me3、HAS3蛋白表达水平升高,HAS2、EZH2蛋白表达水平下降;EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126降低成纤维细胞中(正常组与UVA辐射组)H3K27me3、EZH2蛋白水平的同时,增加HAS2、HAS3蛋白表达。结论:1.不同剂量UVA辐射成纤维细胞后,可不同程度诱导成纤维细胞衰老、降低细胞增殖活性、减少成纤维细胞周透明质酸含量,10J/cm2剂量辐射组,成纤维细胞表型发生明显改变。2.不同剂量UVA辐射成纤维细胞后HA合成代谢系统(HAS1、HAS2、HAS3、CD44、Hyal-1、Hyal-2)、HA参与相关调控通路分子(EGF/EGFR、Smad2/Smad4、P16、MMP-1)及Pc G蛋白复合体关键分子(EZH2、BMI-1)基因表达于12h明显上调,24h后呈现一定下调趋势。3.我们首次观察到EZH2甲基化转移酶抑制剂GSK126可减少UVA辐射诱导成纤维细胞衰老程度,提高UVA辐射损伤衰老细胞模型的增殖活性,减少其凋亡比例,增加其周围透明质酸含量,改变UVA辐射损伤诱导成纤维细胞衰老表型。4.同时我们亦首次研究探讨了组蛋白修饰对HA的表达影响,我们发现抑制H3K-27me3后,在转录水平上课上调HAS2、HAS3、CD44及P16基因的表达,同时下调MMP-1基因的表达。在蛋白水平上调HAS2、HAS3的表达。以上结果提示:Pc G家族可通过组蛋白H3K27me3修饰调控HA的表达,特别是HAS2、HAS3仍需要进行Chip-sequence等实验进一步证实EZH2、H3K27-me3与以上关键基因启动子区域的结合,为HA的组蛋白修饰调控作用研究积累科学基础。同时我们也期望可以从天然植物单体库中筛选出GSK126类似小分子化合物,通过抑制H3K27me3水平,保护紫外辐射所致皮肤损伤,开发一种皮肤光老化天然保护剂。