论文部分内容阅读
【目的】肾癌是泌尿系统常见肿瘤,约有三分之一的肾癌患者在发现时即已为晚期。转移性肾癌目前尚无有效治疗方法,五年生存率不到20%,严重影响我国人民的生命健康。CXCR4是一种趋化因子,在机体内发挥着重要的生理病理功能。国内外大量研究证据表明CXCR4与肿瘤转移有关,现在认为其活化后可以激活下游多种信号通路从而影响肿瘤的发生和发展。本实验指在探寻CXCR4在肾癌细胞中相互作用的蛋白和DNA,丰富CXCR4促进肾癌转移的通路。【研究方法】1.课题组已构建包装高表达CXCR4-EGFP的慢病毒载体,转染病毒得到过表达CXCR4的肾癌细胞系ACHN,并通过实时荧光显微镜和定量PCR验证转染效果。2.利用蛋白质免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀技术检测ACHN细胞内与CXCR4相互作用的蛋白和DNA,通过质谱分析和测序分别测定细胞内与ACHN相互作用的蛋白和DNA。3.针对质谱分析的结果进行验证。质谱分析得到与CXCR4结合的蛋白有e EF1A1(Eukrryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 1,e EF1A1)。设计相对应的si RNA使其低表达,包装干扰慢病毒,转染,构建稳定低表达的ACHN细胞系。4.通过细胞增殖实验、细胞凋亡实验、细胞迁移和实验研究其与肾癌转移的关系。进行细胞功能实验,对转染EGFP慢病毒的ACHN细胞,e EF1A1干扰的ACHN-EGFP细胞,高表达CXCR4的ACHN-CXCR4细胞及干扰e EF1A1的ACHN-CXCR4细胞进行CCK8增殖、流式细胞凋亡、Transwell细胞迁移实验,探讨e EF1A1对肾癌细胞功能的影响,并通过比较在CXCR4高表达时敲低e EF1A1表达来初步探讨CXCR4与e EF1A1相互作用对肾癌细胞功能的影响。5.选取98例肾癌标本构建组织芯片,进行免疫组化染色,统计各标本e EF1A1表达量的高低,结合患者的预后,初步探讨e EF1A1与肾癌预后的关系。【实验结果】1.构建过表达CXCR4-EGFP融合蛋白的肾癌细胞系ACHN构建成功。转染ACHN细胞,荧光显微镜下可见ACHN细胞>90%发出绿色荧光,实时定量PCR显示转染CXCR4-EGFP过表达病毒后ACHN内CXCR4表达量提高7499倍,蛋白质免疫印迹显示融合蛋白大量表达。2.免疫共沉淀获取和CXCR4相互作用的蛋白质,跑胶后送质谱分析,质谱分析提示约在50KDa位置存在条带可能是e EF1A1。进一步通过western验证此结论,在50KDa附近位置加入e EF1A1一抗,有明确条带显示,证实肾癌细胞系ACHN内CXCR4与e EF1A1存在相互作用。3.通过查询基因数据库,设计e EF1A1的干扰RNA,干扰序列为GCACCAUGAAGCUUUGAGUGAAGCTT GCUUCACUCAAAGCUUCAUGGUGCTT。此序列构建sh RNA干扰慢病毒并转染ACHN细胞和ACHN-CXCR4细胞,并通过实时定量PCR和western验证干扰效率约为70%,即干扰组e EF1A1的表达量下调70%,至此构建e EF1A1干扰慢病毒并构建稳定转染的ACHN细胞系成功。4.细胞功能实验证实干扰e EF1A1后肾癌细胞的凋亡稍增加,增殖减慢,迁移无明显变化。高表达CXCR4的ACHN-CXCR4在干扰掉e EF1A1后凋亡明显增加,增殖减慢幅度更大,而迁移能力无明显变化。提示e EF1A1增强了肾癌细胞的增殖能力,而其部分机制可能是通过与CXCR4相互作用实现的。而e EF1A1对肾癌细胞的迁移能力无明显影响。5.组织芯片显示e EF1A1高表达的肾癌预后较差。【实验结论】CXCR4和e EF1A1在肾癌细胞ACHN内促进细胞的增殖,其相互作用更增加了这一趋势。肾癌组织中高表达e EF1A1提示预后不良。