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第一部分Tim-3对Th1／Th2细胞平衡的调控在支气管哮喘小鼠中的作用分题1支气管哮喘小鼠外周血CD4~+T淋巴细胞Tim-3表达的研究及其与Th1／Th2细胞因子的关系目的检测支气管哮喘小鼠外周血淋巴细胞中T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白3(T cell Ig and mucin domain-containing molecule-3，Tim-3)的表达及与Th1／Th2细胞因子之间的关系，探讨其在哮喘发生发展中的作用。方法建立小鼠哮喘动物模型，分为三组，正常对照组、哮喘1天组和哮喘7天组，每组8只。收集各组小鼠外周血淋巴细胞，应用逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-polymerase Chain Reaction RT-PCR)检测外周血淋巴细胞Tim-3mRNA的水平，流式细胞分析技术检测CD4~+T淋巴细胞中Tim-3~+的细胞比例(CD4~+Tim-3~+／CD4~+)反映Tim-3蛋白的水平，酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)检测淋巴细胞上清液中自细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)、干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)的水平，并分析Tim-3的表达与IL-4，IFN-γ水平的相关性。结果哮喘1天组和哮喘7天组外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA的水平和CD4~+Tim-3~+／CD4~+显著高于正常对照组(P值均＜0.01)，哮喘7天组显著高于哮喘1天组(P＜0.05)；哮喘1天组和哮喘7天组外周血淋巴细胞上清液中IL-4的水平显著高于正常对照组(P值均＜0.05)，哮喘7天组显著高于哮喘1天组(P＜0.05)；哮喘1天组和哮喘7天组外周血淋巴细胞上清液中IFN-γ的水平显著低于正常对照组(P值均＜0.05)，哮喘7天组显著低于哮喘1天组(P＜0.05)；哮喘7天组外周血淋巴细胞IL-4的水平分别与Tim-3mRNA的表达和CD4~+Tim-3~+／CD4~+呈正相关(r=0.78，r=0.81 P值均＜0.05)，IFN-γ的水平分别与Tim-3mRNA的表达和CD4~+Tim-3~+／CD4~+呈负相关(r=-0.82，r=-0.89 P值均＜0.05)。结论支气管哮喘小鼠外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA和蛋白的水平均显著高于正常对照组，而且哮喘7天组显著高于哮喘1天组；同时Tim-3的表达与IL-4的水平呈高度正相关，与IFN-γ的水平呈高度负相关，提示Tim-3可能在哮喘的发生、发展中起着一定的作用并且与Th1／Th2失衡密切相关。分题2支气管哮喘小鼠气道T淋巴细胞中Tim-3表达的研究目的检测支气管哮喘小鼠气道T淋巴细胞中Tim-3的表达及IL-4、IFN-γ的分泌情况，探讨它们在哮喘免疫学发病机制中的作用。方法将24只昆明小鼠随机分成三组，正常对照组、哮喘1天组和哮喘7天组，每组8只。收集各组小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，使用Wright-Giemsa染色法分类计数肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞(eosinophile，EOS)计数，应用逆转录-聚合酶链反应检测肺泡灌洗液炎性细胞中Tim-3mRNA的水平，流式细胞分析技术检测CD4~+T淋巴细胞中Tim3~+细胞的比例，用CD4~+Tim-3~+／CD4~+代表Tim-3蛋白的水平，ELISA检测支气管肺泡灌洗液炎性细胞上清液中IL-4，IFN-γ的水平，并分析EOS的表达与Tim-3，IL-4，IFN-γ水平的相关性。结果哮喘7天组肺泡灌沈液中自细胞总数、EOS计数及上清液中IL-4含量均显著高于哮喘1天组和正常对照组(P值均＜0.01)，并且哮喘1天组高于正常对照组(P＜0.05)；哮喘7天组肺泡灌洗液中IFN-γ含量均显著低于哮喘1天组和正常对照组(P值均＜0.01)，并且哮喘1天组低于正常对照组(P＜0.05)；哮喘1天组和哮喘7天组肺泡灌洗液细胞中Tim-3mRNA的水平和CD4~+Tim-3~+／CD4~+显著高于正常对照组(P＜0.01)，哮喘7天组显著高于哮喘1天组(P＜0.05)；哮喘7天组肺泡灌洗液细胞中EOS计数分别与Tim-3mRNA、CD4~+Tim-3~+／CD4~+及上清液中IL-4的水平呈正相关(r=0.73，r=0.79，r=0.86 P值均＜0.05)，与IFN-γ的水平呈负相关(r=-0.81，P＜0.05)；哮喘7天组肺泡灌洗液炎性细胞中Tim-3mRNA和CD4~+Tim-3~+／CD4~+分别与上清液中IL-4的水平呈正相关(r=0.75，r=0.78，P值均＜0.05)，与IFN-γ的水平呈负相关(r=-0.83，r=-0.87，P值均＜0.05)。结论哮喘小鼠肺泡灌洗液炎性细胞中Tim-3mRNA和蛋白的水平均显著高于正常对照组，提示Tim-3在哮喘的发病机制中起了一定的作用；在哮喘7天组的小鼠肺泡灌沈液炎性细胞中Tim-3的表达均显著高于哮喘1天组，提示Tim-3在哮喘的持续发作中可能也起了一定的作用。另外，肺泡灌洗液炎性细胞中EOS计数与Tim-3mRNA和CD4~+Tim-3~+／CD4~+的水平呈正相关，这提示Tim-3和哮喘小鼠气道EOS性炎症可能有一定的联系；Tim-3的高表达与与IFN-γ的水平呈负相关，提示Tim-3可能与支气管哮喘中Th1／Th2细胞失衡有关。分题3 Tim-3中和抗体对哮喘小鼠T淋巴细胞功能的影响目的了解Tim-3中和抗体对哮喘小鼠外周血及肺泡灌洗液中T淋巴细胞体外增殖功能和细胞因子合成功能的影响情况，探讨其治疗哮喘的可能机制。方法将16只昆明小鼠随机分成2组(正常组8只，哮喘组8只)，分别采集外周血和肺泡灌洗液，并分离出T淋巴细胞，体外分组培养(分空白组，Tim-3中和抗体干预组)，干预组以不同浓度干预不同时间。用四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)分别测定各组T淋巴细胞的增殖情况，用ELISA法测定T淋巴细胞上清液中IL-4、IFN-γ的水平。结果与空白组比较，Tim-3中和抗体对体外培养的哮喘和正常小鼠外周血和BALF中T淋巴细胞的增殖均有明显的抑制作用，其抑制率(在一定范围内)随着中和抗体剂量的增加和时间的延长而增强(P值均＜0.05)；但是对哮喘小鼠T淋巴细胞的抑制作用明显强于正常小鼠(P＜0.05)；同时哮喘小鼠抗体干预组T淋巴细胞IL-4的表达水平较空白组明显下降，IFN-γ的水平明显增加(P＜0.05)。结论Tim-3中和抗体能抑制哮喘小鼠T淋巴细胞的增殖和IL-4的合成，增加IFN-γ的分泌。Tim-3可能作为哮喘治疗新的分子靶点。第二部分：Tim-3对Th1／Th2细胞平衡的调控在支气管哮喘患者中的作用分题1外周血淋巴细胞Tim-3 mRNA的表达与哮喘发病及肺功能相关性的研究目的检测哮喘患者外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA的表达，并分析其与上清液中IL-4，IFN-γ的水平和肺功能的相关性，探讨Tim-3mRNA在哮喘发生发展中的作用。方法收集哮喘患者44例，其中缓解期21例，轻至中度急性发作期23例，另选17名健康者作为对照，利用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA的表达并做半定量分析，利用酶联免疫吸附试验检测淋巴细胞上清液中IL-4，IFN-γ的水平，并测定所有受试者的肺功能，分析Tim-3mRNA与IL-4，IFN-γ的水平和肺功能的相关性。结果哮喘发作期外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA及IL-4的水平明显升高，与缓解期和健康对照组比较差异有统计学意义(P值均＜0.05)，缓解期较健康对照组升高明显，差异有统计学意义(P值均＜0.05)；哮喘发作期外周血淋巴细胞上清液中IFN-γ的水平较缓解期和健康对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，缓解期也低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。哮喘发作期外周血淋巴细胞中Tim-3mRNA的表达水平与IL-4呈正相关(r=0.68，P＜0.05)，与IFN-γ和肺功能分别呈负相关(r=-0.85，r=-0.76，P值均＜0.01)。结论Tim-3mRNA的表达在哮喘患者外周血淋巴细胞中是明显高于正常人群，且在哮喘发作期高于缓解期，提示Tim-3可能参与哮喘的发生与发展。哮喘患者无论是在哮喘发作期还是在哮喘缓解期外周血淋巴细胞Tim-3mRNA表达与第一秒用力呼气量(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)、1秒率FEV1／FVC(％)呈负相关，提示Tim-3有可能作为间接反映哮喘气道阻塞及病情严重程度的一个指标。分题2哮喘患者诱导痰中Tim-3mRNA表达的研究目的了解哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3mRNA的表达及IL-4，IFN-γ的分泌情况，并探讨其与肺功能的相关性，分析它们与气道炎症的关系。方法53例哮喘患者，其中缓解期25例，轻至中度急性发作期28例，另选19名健康者作为对照，采用Wright-Giemsa染色法对诱导痰中炎性细胞进行分类计数，逆转录-聚合酶链反应技术检测Tim-3mRNA在诱导痰炎性细胞中的表达，ELISA法测定诱导痰上清液中IL-4，IFN-γ的含量，并测定所有受试者的肺功能。结果哮喘发作期诱导痰炎性细胞中EOS和Tim-3mRNA的表达、IL-4的水平均显著高于健康对照组(P值均＜0.05)，缓解期也高于健康对照组，差异有统计学意义(P值均＜0.05)；哮喘发作期诱导痰上清液中IFN-γ的水平和FEV1、FEV1／FVC(％)显著低于健康对照组(P值均＜0.05)，缓解期也低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；哮喘发作组诱导痰炎性细胞中Tim-3mRNA的表达水平与EOS计数和IL-4呈正相关(r=0.76，r=0.65，P值均＜0.05)，与IFN-γ和肺功能分别呈负相关(r=-0.89，r=-0.78，P值均＜0.01)。结论支气管哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3mRNA的表达明显高于健康对照者，且急性发作期高于缓解期，提示Tim-3可能参与哮喘的发生与发展；哮喘患者气道炎性细胞中Tim-3mRNA的表达与EOS计数和IL-4的水平呈正相关，与IFN-γ呈负相关，因此检测诱导痰炎性细胞中Tim-3mRNA的表达不仅可以从分子水平反映哮喘气道的慢性炎症，同时结合诱导痰炎性细胞中嗜酸性粒细胞含量可以全面了解炎症情况，从而为长期抗炎治疗提供理论基础。