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从北京地区疑似犬细小病毒感染的病死犬血样粪便中分离到5株病毒并进行病毒鉴定,证明为犬细小病毒。对5株分离病毒VP2基因进行扩增和序列分析。选取其中一株分离病毒(BJ5)做动物发病模型攻击病毒并建立犬细小病毒动物发病模型,为评价新型犬细小病毒疫苗效力做准备。以CrFK细胞做病毒分离细胞,病料接入细胞经2次冻融传代后出现稳定的血凝特性(HA),并能被CPV标准阳性血清所抑制;以荧光标记的CPV单克隆抗体做免疫荧光试验,结果显示分离病毒感染的细胞出现蓝绿色的胞浆荧光;用犬细小病毒特异性鉴定引物对病毒基因进行扩增,能够扩增出预期的583bp基因片段。上述鉴定结果证明5株分离病毒均为CPV。采用PCR方法分别对5株犬细小病毒VP2基因片段进行扩增并对该片段进行序列测定和DNAStar软件分析。所扩增VP2基因片段长度为1755bp,并与GenBank收录的部分CPV的VP2基因进行同源性比较及系统发育树分析。5株分离病毒同美国株CPV-b(type 2)、CPV-15(type 2a)、CPV-39(type 2b)比较,核苷酸同源率为99.0%~99.5%,氨基酸同源率为98.6~99.5%,表明VP2基因变异相对较少,5株分离病毒与CPV-2a型毒株第426位氨基酸相同,均为Asn;5株分离病毒的VP2基因与CPV-2a亚型毒株的氨基酸的相似性超过98%,通过系统发育树分析表明,5株分离病毒处于同一分支,与标准参考毒株差异不显著。为确定攻毒途径和最低攻击剂量,建立犬细小病毒动物发病模型,选取CPV血凝抑制价≤10的阴性健康犬,以分离病毒BJ5作为攻击病毒。第1次实验为攻毒途径实验,选取6只实验犬分为3组,每组2只,第1组皮下注射分离病毒1 mL/只;第2组口服分离毒1 mL/只;第3组为对照组,皮下注射CrFK细胞液1mL/只。攻击病毒后,每天观察临床症状(包括饮欲、食欲、粪便性状、精神状态等);测定直肠体温;采集肛拭子用于血凝试验以检测排毒;分别于第0,7,14天采血分离血清,通过HI方法检测CPV抗体水平。结果显示:第1,2组实验犬攻击分离病毒14天内均表现为食欲减退,饮欲增加,腹泻及血便等典型临床症状;直肠温度升高;两组实验犬粪便中可检测到排毒;对照组无临床症状。然而第1组与第2组相比较,动物攻毒后潜伏期较短,临床症状较明显。第2次实验为最低攻击剂量实验,共设5组(A,B,C,D,E),每组2只动物, A、B、C、D组为攻毒组,皮下注射攻毒,攻击剂量分别为103.5TCID50/mL, 102.5TCID50/mL, 101.5TCID50/mL,100.5TCID50/mL,1mL/只;E组为对照组,皮下注射CrFK细胞培养液,1mL/只。结果显示:A,B组动物均发病出现典型的细小病毒感染的症状,C组犬出现轻微临床症状,体温升高,粪便中检测到排毒,但与B组相比较潜伏期较长,症状不明显;D组和E组无临床症状。上述实验表明犬细小病毒发病模型以皮下注射为最佳途径,以102.5TCID50/mL,1mL/只为最佳攻毒剂量。