奶牛乳腺炎（Bovine mastitis）主要由微生物感染乳腺所致,严重危害世界各国奶业发展。引起奶牛乳腺炎的微生物主要有链球菌、葡萄球菌、肠杆菌等,其中链球菌是引起奶牛乳腺炎最常见的细菌。由于临床上长期使用抗生素预防和治疗奶牛乳腺炎,导致链球菌耐药菌株大量增加,且疗效不佳。因此,人们尝试使用疫苗来防控链球菌性奶牛乳腺炎。目前,我们研制的由链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C_1-150aa(Gap C_1-150)构建的候选疫苗GIT(Gap C_1-150-Isd B_137-361-Tra P)正在进行预防奶牛乳房炎临床试验,但对该疫苗免疫接种奶牛产生的抗体缺少有效的检测方法,无法评价GIT诱导的体液免疫应答。因此,本实验拟选用无乳链球菌Gap C_1-150重组蛋白和串联Gap C_1-150的2个B细胞表位肽分别作为抗原,建立奶牛血清抗体间接ELISA检测方法。用PCR方法扩增无乳链球菌HLJ57株的gap C_1-150基因,插入p ET-32a载体并转化至感受态细胞BL21（DE3）中,表达并纯化Gap C_1-150蛋白,与弗氏佐剂等体积配伍后肌肉免疫接种6-18月龄的健康Holstein育成牛,于加强免疫后10-14天采血,制备免疫血清。用p GEX-6p-1载体表达Gap C_1-150作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法。实验确定抗原包被最佳浓度为2.5μg/m L,血清稀释度最佳为1/1000;优化了间接ELISA反应条件;对52份非免疫牛血清和17份免疫牛血清进行ELISA检测,确定cut-off值为0.487;分别对候选疫苗GIT、金黄色葡萄球菌Trap和Isd B蛋白、p ET32a标签蛋白、金黄葡色葡萄球菌Wood46、无乳链球菌HLJ57免疫血清以及大肠杆菌腹泻牛血清、牛副结核阳性血清、牛布氏杆菌阳性血清进行检测,结果显示除GIT免疫血清呈阳性外其它血清均为阴性;当Gap C_1-150阳性血清稀释度1/16000时P/N值仍大于2.1;批内变异系数为3.6%-9.6%,批间变异系数为1.59%-9.81%。用该ELISA方法检测85份待检成牛血清,阳性率为10.59%。为进一步寻求更加特异、灵敏的检测方法,用串联的Gap C_1-150 B细胞表位肽³⁰TRINDLT³⁶AAY⁴⁶DTTQGRFDGT⁵⁵（命名为TT-20）作为抗原建立ELISA检测方法。试验确定抗原包被浓度15μg/m L;血清稀释度为1/800;cut-off值为0.36;当阳性血清稀释度为1/6400时P/N值仍大于2.1;与对照抗原免疫血清和病原感染血清均未发生交叉反应;批内变异系数为1.4%-3.6%;85份待检牛血清阳性率为17.65%。以上结果表明,以Gap C_1-150为抗原建立的间接ELISA检测方法特异性强,敏感性好,优于以TT-20为抗原所建立的间接ELISA检测方法,适于链球菌Gap C_1-150抗原和GIT候选疫苗免疫免疫后血清抗体检测。