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近年来,有关于植物多糖的免疫调节方面的相关研究已愈来愈得到人们的关注。据报道,植物多糖可以受体相互识别,进而激活相关信号通路,介导免疫调节反应。目前发现主要的植物多糖受体包括补体受体3、TLRs、清道夫受体、Dectin-1以及甘露糖受体等。本课题组已有研究表明,锦灯笼果实水溶性多糖(PPSB)在白色念珠菌核酸疫苗中发挥了显著的免疫增强效应。对其作用机制的初步探究结果证明,PPSB可以促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)表型成熟、活化MAPKs及NF-κB两条信号通路,然而有关其作用靶点尚不清楚。本研究在上述工作的基础上,以合成的PPSB-FITC为探针,探讨免疫细胞(RAW264.7和DC2.4)TLR2和TLR4是否为PPSB的作用靶点,为进一步阐明PPSB的免疫佐剂效应机制奠定基础。现将本论文主要研究结果总结如下:1.合成PPSB-FITC利用酪胺还原的方法对PPSB进行荧光标记,得到标记产物PPSB-FITC。细胞毒性检测结果表明,PPSB-FITC没有对细胞产生毒性作用。将PPSB-FITC与PPSB共同孵育DC2.4细胞,PPSB-FITC与细胞结合率明显下降(P<0.05),证明FITC没有改变PPSB与免疫细胞的结合位点。上述实验结果表明PPSB-FITC可以作为探针用于PPSB与免疫细胞表面结合位点的相关研究。2.PPSB与免疫细胞TLR2和TLR4结合本实验培养DC2.4和RAW264.7两种免疫细胞,通过以下两种实验方法探究PPSB与免疫细胞TLR2和TLR4的结合:(1)竞争性结合实验。PGN是免疫细胞TLR2的配体,LPS是免疫细胞TLR4的配体;先将免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)与PGN或LPS共孵育,再加入PPSB-FITC,FCM检测PPSB-FITC与细胞结合率的改变情况,初步探讨PPSB与免疫细胞TLR2和TLR4结合。(2)抗体抑制实验。先将免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)与Anti-TLR2或Anti-TLR4共孵育,再加入PPSB-FITC,FCM检测PPSB-FITC与细胞的结合情况,进一步探讨TLR2和TLR4为PPSB与免疫细胞的结合位点。(1)PPSB与免疫细胞表面TLR2结合由竞争性结合实验结果可知,加入PGN的各实验组与Control组相比,PPSB-FITC与免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)的结合率下降显著(P<0.05);说明PPSB与PGN竞争性结合免疫细胞,可以推测PPSB可以与免疫细胞表面的TLR2结合。通过对抗体抑制实验结果分析可知,加入Anti-TLR2的实验组与Control组相比,PPSB-FITC与免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)的结合率显著降低(P<0.05);说明PPSB与Anti-TLR2存在相同的结合位点,即TLR2是PPSB与免疫细胞的结合位点。上述实验结果证明PPSB可以与免疫细胞表面的TLR2结合。(2)PPSB与免疫细胞表面TLR4结合由竞争性结合实验结果可知,加入LPS的实验组与Control组相比,PPSB-FITC与免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)的结合率下降显著(P<0.05);说明PPSB与LPS竞争性结合免疫细胞。通过对抗体抑制实验结果分析可知,加入Anti-TLR4的各实验组与Control组相比,PPSB-FITC与免疫细胞(DC2.4和RAW264.7)的结合率显著下降(P<0.05);说明PPSB与Anti-TLR4存在相同的结合位点,即TLR4是PPSB与免疫细胞的结合位点。上述实验结果证明PPSB可以与免疫细胞表面的TLR4结合。综上所述,免疫细胞表面的TLR2和TLR4是锦灯笼果实多糖PPSB的作用位点。