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一、目的甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)是一种叶酸类似物,可竞争性抑制二氢叶酸还原酶,使四氢叶酸产生受阻而干扰细胞DNA及RNA的合成。小剂量口服MTX无免疫抑制活性而有抗炎效应,可用于治疗特应性湿疹、老年泛发性湿疹、迟发性特异性皮炎或原发性湿疹及成人中重度湿疹等,但其明显的肝毒性严重影响了其广泛使用。考虑皮肤疾病主要是局部的炎性病变,局部给药应具有更好的应用前景。本文通过对MTX基本理化性质的研究,构建并初步评价MTX柔性纳米脂质体(Flexible Nano-liposomes,FNL)凝胶,比较其与同浓度普通凝胶在降低药物渗透量,提高皮肤滞留量方面的优势；观察MTX-FNL凝胶对临床上湿疹治疗的有效性及安全性,探索其局部外用治疗湿疹的可行性及合理的施药形式,为MTX外用治疗湿疹的开发奠定基础。研究结果也将为MTX外用治疗银屑病等其他皮肤疾病提供参考。二、方法与结果1.MTX理化性质及包封率测定方法的研究建立MTX含量的测定方法并测定25℃时,MTX在不同pH水溶液中的溶解度及油/水分配系数。结果,MTX的溶解度及油/水分配系数均受pH影响。25℃时微溶于水,略溶于pH7.4的PBS溶液中(10.856±0.127mg·ml-1),亲脂性较差,logP均小于-1.43(pH=6.8)。2. MTX-FNL的构建及表征采用逆向蒸发法制备MTX-FNL,以包封率及粒径为评价指标,通过单因素考察筛选了磷脂用量、磷脂-CH比(w/w)、膜软化剂用量、油水体积比、水化时间等处方工艺因素,通过正交设计确定处方工艺并制得粒径为212.70+3.93 nm,包封率为25.62±0.18%的MTX-FNL混悬液。该混悬液于室温及4℃放置10 d,基本稳定。3. MTX-FNL体外经皮渗透性研究建立了HPLC法测定体外经皮渗透试验中接收液及皮肤中MTX的浓度的方法,该方法专属性高,皮肤中的内源性物质不干扰测定。采用改良Franz扩散池研究了两种膜软化剂的用量对MTX-FNL在离体乳猪皮肤中的体外经皮渗透行为的影响。结果表明,Doc-Na及KG的用量对脂质体的经皮渗透行为都有明显影响,随着膜软化剂用量的增加,24 h单位面积累积渗透量(Q24)变化无显著性差异(P>0.05)24 h单位质量皮肤滞留量(Qskin)则随之增加(P>0.05)。结合处方筛选结果,当磷脂-KG比(w/w)为10：1时,脂质体包封率较高,且MTX渗透量较低,皮肤滞留量较高。故在后续的脂质体凝胶剂的构建中,选用KG(与磷脂比(w/w)为10：1)作为膜软化剂。4. MTX-FNL凝胶的构建及质量评价构建了0.25%MTX-FNL凝胶、0.0625%MTX-FNL凝胶(采用微柱离心法除去脂质体混悬液中游离药物后制备FNL凝胶)及同浓度的普通凝胶,考察其在离体乳猪皮肤中的体外经皮渗透行为。结果显示,同浓度的FNL凝胶的Q24明显较普通凝胶低(P<0.05), Qskin均高于普通凝胶,约为后者的2倍,且差异均有显著性(P<0.05)。FNL凝胶可明显减少MTX的Q24,提高Qskin,提示其可能对湿疹具有更好的治疗效果。选择0.25%MTX-FNL凝胶进行临床湿疹治疗的有效性及安全性考察。5. MTX-FNL的皮肤刺激性及初步临床疗效观察单次、多次给予0.25%MTX-FNL凝胶对家兔正常及破损皮肤均无刺激性。观察0.25%MTX-FNL凝胶与疗效确切的卤米松三氯生软膏(即新适确得软膏)治疗湿疹的有效性及安全性,结果治疗组与对照组治疗后的EASI评分及瘙痒程度评分均无显著性差异(P>0.05),表明治疗组几乎可达到与对照组相当的治疗效果,且两组在治疗期内均未观察到不良反应。但MTX-FNL是否通过滞留皮肤局部发挥药效还有待进一步证实。三、结论MTX的水溶性及经皮渗透能力较差,FNL技术可提高MTX的经皮渗透能力,同时可明显减小其渗透量,提高皮肤滞留量；单次、多次给予0.25%MTX-FNL凝胶对家兔正常及破损皮肤均无刺激性；0.25%MTX-FNL凝胶与已上市的卤米松三氯生软膏对湿疹几乎具有相当的治疗效果,且在观察期内无不良反应。但MTX-FNL在皮肤内的滞留位置和量与治疗湿疹疗效间的关系还有待进一步研究。