目的：Krüppel样因子4（Krüppel-like factor4，KLF4）是一种含有锌指结构的转录因子，在多种组织和细胞中广泛存在。在不同细胞内环境中，KLF4作为一种基础转录因子，可激活或抑制多种基因的转录并调节包括增殖、分化、发育、炎症和凋亡在内的多种细胞生物学过程。因此，KLF4基因的表达调节和功能改变是影响细胞生物学行为的重要因素之一。前期的研究表明，KLF4基因功能的调节是复杂的网络调节过程，既可以通过转录水平进行调节，又可以通过转录后翻译修饰水平调节，后者包括磷酸化、乙酰化、苏素化及泛素化等过程的调节。此外，大量实验证据表明，多种刺激因素均可影响细胞内KLF4的水平，如血清饥饿、氧化应激、血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）、丁酸盐、环孢素、硒、转化生长因子β（transforming growthfactor-β，TGF-β）、干扰素-γ、环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）。本室前期研究发现，ATRA除可诱导KLF4表达外，还可以促进KLF4乙酰化和磷酸化修饰，进而转录激活血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）分化标志基因SM22α和SM α-actin并促进VSMC向分化表型转化。此外，Owens等人发现转录因子激活蛋白-1（transcription factor stimulatingprotein-1，Sp1）参与VSMC中Klf4基因的转录调节；Yang等人报道KLF4可通过自调控方式调节Klf4基因转录。ATRA是膳食摄入维生素A的代谢产物，可通过结合其胞内核受体RAR和RXR而直接调节下游靶基因转录并促进VSMC分化。RAR可与靶基因启动子区的维甲酸应答元件（retinoic acid response element，RARE）直接结合而调控靶基因的转录。未结合配体的RAR往往与辅抑制子构成转录抑制复合体而使基因沉默；结合配体后，RAR募集一系列辅转录激活因子从而激活下游基因的转录。此外，RAR还可通过与其他转录因子结合而间接调节基因转录，如RAR可通过与转录因子Sp1/Sp3或STAT5结合而间接结合在启动子区的Sp1/Sp3或STAT5结合位点发挥转录调控作用。目前，RAR被认为是治疗VSMC增殖性疾病的重要靶分子。在临床治疗中，ATRA已经成功的运用于白血病、癌症及动脉再狭窄和斑块形成等疾病的治疗。然而，ATRA诱导Klf4基因表达的分子机制目前仍不十分清楚。本研究系统的探讨了VSMC中ATRA信号在诱导Klf4基因转录过程中的作用及其分子机制。方法：细胞培养，腺病毒及质粒载体的构建，定点突变，小干扰RNA转染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Western印迹分析，荧光素酶报告基因分析，染色质免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，GSTpull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU掺入分析，细胞迁移分析，鬼笔环肽细胞骨架染色等。结果：1RARα介导ATRA诱导的Klf4基因表达ATRA通过与其受体RAR和RXR结合而发挥转录调节的作用。RAR有三种亚型：RARα、RARβ和RARγ，分别由不同的基因编码。本部分研究证实RARα，而不是RARβ或RARγ，参与了ATRA诱导的Klf4基因表达。结果如下：1.1ATRA以浓度和时间依赖性方式诱导KLF4和RARα表达为了探讨ATRA诱导KLF4与ATRA受体（RARα、RARβ和RARγ）表达之间的关系，我们首先应用Western印迹分析方法检测不同浓度ATRA刺激VSMC不同时间后，KLF4和三种RAR的表达水平。结果显示，ATRA可显著诱导KLF4和RARα的表达，且呈剂量和时间依赖性。然而，ATRA刺激后，RARβ和RARγ表达水平无显著变化。1.2RARα介导ATRA诱导的Klf4基因表达为了进一步探寻介导ATRA诱导Klf4基因转录的核受体，我们应用小干扰RNA（si-RARα，si-RARβ和si-RARγ）分别敲低三种内源性RAR的表达。结果显示，在敲低内源性RARα的细胞中，ATRA对Klf4表达的诱导作用受到显著抑制。用RARα选择性抑制剂Ro41-5253抑制RARα活性后再用ATRA刺激VSMC，ATRA对Klf4表达的诱导作用受到部分抑制。此外，应用腺病毒表达载体Ad-GFP-RARα在VSMC中过表达RARα可增强ATRA对Klf4表达的诱导作用。为了探明RARα介导Klf4表达是否通过其激活Klf4启动子的转录活性，应用Klf4启动子报告基因和RARα、RARβ和RARγ的表达质粒共转染CHO-K1细胞后进行荧光素酶活性分析。结果显示，RARα过表达可显著增强ATRA对Klf4启动子的激活作用，Ro41-5253预处理减弱ATRA对Klf4启动子的转录激活作用。以上结果表明，RARα介导ATRA对Klf4启动子的转录激活。1.3ATRA通过Klf4启动子近端的三个GC盒调节KLF4基因表达为了检测Klf4启动子中RARα的应答元件，我们构建了5’-端缺失的Klf4启动子报告基因进行荧光素酶报告基因分析。结果显示，ATRA刺激后，Klf4启动子近端区域（-179至+20）的转录激活作用最强，序列分析，发现该区域含有三个GC盒。为了证实这三个GC盒是否为ATRA诱导Klf4表达所必需，我们突变不同GC盒后进行报告基因分析。结果显示，单独突变一个GC盒后，ATRA对Klf4启动子的激活作用下降64-80%，突变两个GC盒后对Klf4启动子的诱导作用降低85%，同时突变三个GC盒则使ATRA失去对Klf4启动子的激活作用。以上结果表明，Klf4启动子近端的三个GC盒协同参与ATRA对Klf4基因的转录激活作用。1.4RARα募集在Klf4启动子近端GC盒上并促进Klf4转录染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation， ChIP）结果显示，ATRA显著促进RARα在Klf4启动子近端的结合。寡核苷酸pull-down分析显示，ATRA促进RARα与含GC1/2和GC3盒序列的探针结合，GC盒突变阻断RARα与该探针的结合。这些结果进一步证实，ATRA促进RARα与Klf4启动子近端GC盒结合。为了明确RARα与Klf4启动子结合是否影响Klf4启动子的转录活性，用RARα表达质粒和Klf4野生型及GC盒突变型启动子报告基因共转染CHO-K1细胞后进行荧光素酶活性分析。结果显示，RARα过表达可显著增强ATRA对Klf4启动子的激活，GC盒突变后RARα对Klf4启动子的转录激活作用消失。以上结果表明，RARα以GC盒依赖性方式介导ATRA诱导的Klf4基因表达。2KLF4、Sp1和YB1通过与GC盒结合而激活Klf4启动子研究表明，RAR可通过与其它转录因子结合而以RARE非依赖性方式调节基因转录。因此我们推测，RARα可能通过与一个或多个GC盒结合蛋白相互作用而调节Klf4转录。本部分研究结果显示，ATRA可诱导KLF4、Sp1和Y-box结合蛋白1（Y-box binding protein1，YB1）与GC盒直接结合，RARα通过与KLF4、Sp1及YB1相互作用而调节Klf4转录。结果如下：2.1ATRA促进RARα与KLF4、Sp1及YB1相互作用以往研究发现， KLF4和Sp1可与Klf4启动子近端结合并调节Klf4基因转录。为了寻找新的介导ATRA激活Klf4转录的核因子，我们以生物素标记的Klf4启动子近端双股核苷酸片段（-179至+20）为探针，从VSMC裂解液中亲和纯化与DNA结合的转录因子。结果显示，经ATRA刺激后，该探针可以沉淀出一种分子量为36kDa的蛋白。经HCT质谱分析及氨基酸序列比对显示该蛋白为YB1。Co-IP分析结果显示，ATRA促进RARα与KLF4、Sp1及YB1的相互作用。采用过表达GFP-RARα的CHO-K1细胞裂解液进行GST pull-down分析的结果显示，GFP-RARα可与原核细胞表达的GST-KLF4、GST-Sp1及GST-YB1蛋白纯品直接结合，ATRA增强其结合活性。2.2RARα与KLF4、Sp1和YB1协同激活Klf4基因转录寡核苷酸pull-down分析结果显示，在经ATRA处理的VSMC中，KLF4、Sp1和YB1均可与Klf4启动子近端含GC盒（GC1/2或GC3）的序列结合；GC盒突变后，KLF4、Sp1和YB1与探针的结合活性消失。ChIP分析进一步证实，ATRA刺激可促进KLF4、Sp1和YB1在Klf4启动子近端的聚集。为了探明RARα与KLF4、Sp1和YB1相互作用对Klf4启动子活性的影响，用Klf4启动子报告基因及KLF4、Sp1、YB1和RARα表达质粒共转染CHO-K1细胞进行荧光素酶活性分析。结果显示，单纯过表达KLF4、Sp1或YB1，或同时过表达两种或三种转录因子，均可增强Klf4启动子的转录活性，当同时表达4种转录因子并给予ATRA刺激后，Klf4启动子的转录活性最强。以上结果表明，RARα通过与KLF4、Sp1及YB1相互作用而激活Klf4基因转录。2.3KLF4、Sp1和YB1直接与GC盒结合并协同激活Klf4基因表达为了检测KLF4、Sp1和YB1是否与GC盒直接结合，我们分别用原核细胞表达的GST-KLF4、GST-Sp1、GST-YB1及GST-RARα蛋白纯品进行寡核苷酸pull-down分析。结果显示，GST-KLF4、GST-Sp1及GST-YB1均可与含GC盒（GC1/2或GC3）序列的探针在体外直接结合，随着探针浓度的增加其结合量增多；GC盒突变后则与探针的结合活性消失。此外，寡核苷酸pull-down试验不能观察到GST-RARα与GC探针的结合。提示RARα可能通过间接方式与Klf4启动子结合。用Klf4启动子报告基因及不同转录因子的表达质粒共转染CHO-K1细胞进行荧光素酶活性分析。结果显示，共转染等量的Sp1及不同量的KLF4表达质粒后，随着KLF4表达量的增加，Sp1对Klf4启动子的转录激活作用逐渐增强。同样，共转染等量的KLF4及不同量的Sp1表达质粒，随着Sp1表达量的增加，Klf4启动子的活性亦增强。这些结果表明，KLF4和Sp1协同激活Klf4转录。此外，Sp1和YB1、以及YB1和KLF4都能协同激活Klf4基因转录。2.4KLF4、Sp1和YB1与Klf4启动子结合有赖于RARα的活化应用小干扰RNA技术敲低内源性RARα表达后进行ChIP分析的结果表明，ATRA促进KLF4、Sp1和YB1在KLF4启动子的结合；应用si-RARα下调内源性RARα表达可减小ATRA诱导的这些转录因子在Klf4启动子的募集。以上结果表明，RARα配体化有助于KLF4、Sp1和YB1与Klf4启动子GC盒结合。3ATRA促进RARα以KLF4-Sp1-YB1依赖性方式与Klf4启动子结合为了进一步明确RARα介导Klf4转录的分子机制，我们进一步研究ATRA对RARα和KLF4-Sp1-YB1复合体与Klf4启动子结合的影响。结果如下：3.1ATRA促进RARα与KLF4-Sp1-YB1复合体的结合GST pull-down分析结果显示，在未给予ATRA刺激的VSMC中，KLF4、Sp1和YB1三者形成复合体；加入ATRA刺激后，RARα与KLF4-Sp1-YB1复合体结合活性增强。为了进一步明确KLF4、Sp1和YB1之间存在相互作用，分别应用转染GFP-KLF4、GFP-Sp1和GFP-YB1的CHO-K1细胞裂解液与原核表达的GST-Sp1、GST-YB1和GST-KLF4蛋白纯品进行GST pull-down分析。结果显示，KLF4-Sp1、KLF4-YB1及Sp1-YB1之间均可在体外直接结合。此外，我们也分析了ATRA刺激对KLF4、YB1及Sp1的其它靶基因表达的影响。结果显示，ATRA刺激24小时后，VSMC中SM22α、p53和p21表达均显著增高。3.2ATRA促进RARα以KLF4-Sp1-YB1依赖性方式与Klf4启动子结合为了明确RARα在Klf4启动子上的募集是否依赖于KLF4-Sp1-YB1复合物与Klf4启动子的结合，分别敲低内源性KLF4、Sp1和YB1后，采用ChIP分析检测RARα在Klf4启动子的结合情况。结果显示，ATRA处理使RARα在Klf4启动子上的结合活性显著增强；应用si-RNA分别敲低内源性KLF4、Sp1或YB1可显著抑制RARα在Klf4启动子的募集。此外，将KLF4、Sp1或YB1表达质粒与RARα表达质粒共转染CHO-K1细胞，以含GC1/2或GC3序列的寡核苷酸为探针进行pull-down分析。结果显示，单独过表达RARα时，RARα与GC1/2或GC3探针的结合活性较低；共表达KLF4、Sp1或YB1可显著增加RARα与GC探针的结合。以上结果提示，RARα与Klf4启动子的结合是KLF4-Sp1-YB1依赖性的，ATRA刺激可促进RARα与KLF4-Sp1-YB1复合体的结合。3.3RARα通过KLF4、Sp1和YB1介导Klf4表达应用小干扰RNA敲低VSMC内源性KLF4、Sp1和YB1，同时以腺病毒表达载体Ad-GFP-RARα感染VSMC，观察ATRA刺激对Klf4表达的影响。结果显示，过表达RARα可显著促进ATRA诱导的Klf4表达；敲低内源性KLF4、Sp1和YB1的同时过表达RARα，则减弱了ATRA对Klf4表达的诱导作用。以上结果提示，KLF4、Sp1和YB1是RARα介导Klf4表达所必需的。4YB1与GC盒结合并促进VSMC分化YB1是含冷休克结构域（cold-shock domain，CSD）的蛋白家族成员之一，在基因转录、RNA剪切及mRNA翻译等过程中均发挥重要作用。以往研究表明，YB1通过与含5’-CTGATTGG-3’基序（又称为Y-盒）的双链DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）或富含C/T-或GC/GA-序列的单链DNA（single-stranded DNA，ss-DNA）结合而调控多种基因的转录。本部分研究首次报道，YB1可与含GGGCGG基序（GC盒）的双链DNA直接结合，并进一步探讨了YB1与GC盒结合的分子机制及其在VSMC中的生物学效应。4.1YB1与GC盒直接结合为了探讨YB1与GC盒序列的结合活性，我们设计了几种生物素标记的含GC盒序列的双链DNA探针进行寡核苷酸pull-down分析，以含CACCC序列的探针或GC盒突变的探针作为阴性对照，以含Y-盒序列的探针及串联的4×GC盒探针作为阳性对照。应用VSMC全细胞裂解液、转染GFP-YB1的A293细胞裂解液或原核表达的GST-YB1蛋白纯品，与不同探针共孵育并进行寡核苷酸pull-down分析，以检测YB1与GC盒的结合活性。结果显示，VSMC中的内源性YB1、外源性过表达的GFP-YB1以及纯化的GST-YB1，均可与含GC盒的几种探针相结合，这些与YB1结合的探针包括位于VSMC分化相关基因（SM22α，p21）及增殖相关基因（cyclin D1）启动子中的DNA元件；突变这些探针中的GC盒可阻断其与YB1的结合。与YB1结合活性最强的探针为串联的4×GC盒探针。以上结果表明，YB1可与GC盒直接并特异性结合。4.2YB1与GC盒的结合不依赖其CSD或ss-DNA结合结构域为了检测YB1分子中与GC盒特异性结合的区域，我们应用生物素标记的双链探针a（SM22α启动子）与等量的野生型或不同截短突变的GST-YB1蛋白纯品体外共孵育，并进行寡核苷酸pull-down分析。除与全长的野生型YB1相结合外，含GC盒的探针a也可结合YB1（1-220）、YB1（125-324aa）及YB1（125-220aa）。纯化的YB1（125-220aa）可与探针a或串联的4×GC盒探针体外直接结合，其结合量随探针浓度的增加而增加。此外，在A293细胞中过表达GFP-YB1及GFP-YB1的不同截短突变体，应用该细胞裂解液与GC盒探针共孵育进行寡核苷酸pull-down分析；结果显示，GFP-YB1、GFP-YB1（125-220aa）及GFP-YB1（125-324aa）可与GC盒相结合。以上结果表明，YB1与GC盒的结合不依赖其N-端的CSD（65-125aa）或ss-DNA结合区域（15-71aa），YB1分子中125-220氨基酸序列是其与GC盒结合所必需的。此外，为了比较YB1与ds-DNA或ss-DNA的亲和力，应用生物素标记的ds-GC或ss-GC作为探针，与GST-YB1或GST-YB1（125-220aa）蛋白纯品，或过表达GFP-YB1或GFP-YB1（125-220aa）的A293细胞裂解液共孵育，并进行寡核苷酸pull-down分析。结果显示，全长的GST-YB1或GFP-YB1可结合ds-GC和ss-GC，而缺失ss-DNA结合区域（15-71aa）的截短突变体GST-YB1（125-220aa）或GFP-YB1（125-220aa）则只结合ds-GC探针。这些结果进一步提示，YB1分子中125-220位氨基酸序列决定YB1与GC盒的结合活性。4.3YB1C-端功能域促进VSMC分化为了明确含有GC盒结合区域的YB1分子C-端（125-324aa）是否还能参与GC盒依赖性靶基因的转录调节，应用SM22α或p21启动子报告基因及GFP-YB1或GFP-YB1（125-324aa）表达质粒共转染VSMC后进行荧光素酶活性分析。结果显示，YB1C-端过表达可显著增强SM22α和p21启动子的转录活性。此外，我们构建了编码GFP-YB1或GFP-YB1C-端氨基酸序列的腺病毒表达载体，感染VSMC72小时后进行鬼笔环肽染色，激光共聚焦显微镜下观察YB1或YB1C-端过表达对VSMC细胞骨架形态的影响。结果显示，全长的YB1蛋白在VSMC胞浆和胞核均有分布，并在核周呈颗粒样聚集；而YB1C-端主要定位在胞核中。鬼笔环肽染色显示，YB1过表达使VSMC肌丝变得粗大、排列整齐；YB1C-端过表达后，VSMC形态明显伸长，并形成许多粗大的、沿细胞长轴平行排列的应力纤维。提示YB1C-端可促进VSMC向分化表型转化。为了进一步验证YB1C-端（125-324aa）在VSMC分化中的作用，应用腺病毒表达载体Ad-GFP、Ad-GFP-YB1或Ad-GFP-YB1（125-324aa）感染VSMC72小时并进行Western blot分析。与Ad-GFP感染组相比，GFP-YB1C-端（125-324aa）过表达可显著上调VSMC中SM22α和p21的蛋白表达水平，同时下调增殖相关基因PCNA的表达水平，进一步提示了YB1C-端具有促进VSMC分化并抑制增殖的作用。BrdU掺入分析显示，应用小干扰RNA敲低内源性YB1表达后，VSMC中BrdU相对掺入率增加；当过表达YB1或其C-端功能域后，VSMC中BrdU相对掺入率则受到显著抑制。提示YB1及其C-端功能域发挥抑制VSMC增殖的作用。由于YB1及其C-端功能域过表达可影响VSMC细胞骨架的形态，因此我们进一步检测了YB1对VSMC迁移能力的影响。应用si-YB1敲低内源性YB1，或Ad-GFP-YB1及Ad-GFP-YB1（125-324aa）感染VSMC后，进行Boyden小室或伤口愈合实验分析YB1对VSMC跨膜和平面迁移能力的影响。结果显示，敲低内源性YB1表达可增强VSMC的迁移能力；而过表达YB1或其C-端功能域可显著抑制VSMC的迁移能力。以上结果提示，YB1C-端功能域在YB1诱导VSMC分化过程中发挥重要作用。结论：1ATRA诱导VSMC中KLF4和RARα表达，RARα通过与Klf4启动子中GC盒结合介导ATRA诱导的Klf4基因表达。2ATRA促进RARα与KLF4、Sp1及YB1相互作用，KLF4、Sp1和YB1通过与GC盒直接结合而增强Klf4启动子活性。3ATRA促进RARα以KLF4-Sp1-YB1依赖性方式结合Klf4启动子，KLF4、Sp1和YB1是RARα介导Klf4表达所必需的。4YB1与GC盒直接结合并促进VSMC分化。