论文部分内容阅读
产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)又被称为产Vero细胞毒素大肠杆菌,是一类能够产志贺毒素的大肠杆菌,是近几十年来发现的一群最重要的能够引起人类潜在致命性疾病的食源性致病菌,而EHEC 0157:H7则是其中的典型代表。高危人群老人和儿童感染产志贺毒素大肠杆菌后表现为腹泻、出血性肠炎等症状,易继发感染溶血性尿毒综合征。本研究在2014年对江苏某奶牛场进行定期采样,分离鉴定产志贺毒素大肠杆菌并用Vero细胞和BALB/c小鼠做致病性研究,以脉冲场凝胶电泳作聚类分析绘制出系统进化树做遗传相关性分析,对于了解奶牛场STEC的流行情况等具有重要的意义。1江苏某奶牛场产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定对江苏某奶牛场于2014年3、6、9、12月份进行定期采样,应用本实验室已建立的方法分离产志贺毒素大肠杆菌,以初步了解STEC在该奶牛场的流行情况。用本实验室建立的多重PCR对病原菌的stx1、stx2两个基因进行初步检测,检测阳性的样品,通过挑取CT-SMAC上的菌落继续分离纯化再应用多重PCR检测stx1、stx2、eaeA、ehxA这四个毒力基因,经四重PCR检测阳性的样品则继续分离纯化。本次调查中江苏某奶牛场STEC总的阳性率为12.56%,总分离率为2.07%,犊牛的阳性率为17.50%,犊牛的分离率为4.44%。本次调查中共分离到12种不同的O血清型STEC,包括O13、O16、O25、O55、O68、O161等血清型,也分离到了O55等对人类具有严重危害的血清型,同时O55也是该牛场的优势血清型。本研究选用4株STEC制备细菌毒素接种于Vero细胞,24 h后观察发现细胞变圆、皱缩,之后逐渐死亡。选择3周龄的雌性BALB/c小鼠作为实验模型,将经萘啶酮酸诱导的STEC采用灌胃的方式接种于小鼠,给实验小鼠灌胃的同时采用腹腔注射的方式接种丝裂霉素C,在攻毒后的2-7d内,攻毒组小鼠出现不同程度的死亡,其中STEC 109攻毒组死亡率最高。从攻毒小鼠的病理切片可以观察到小鼠的结肠黏膜的上皮细胞发生坏死脱落,肝脏、脾脏均出现中性粒细胞浸润。2产志贺毒素大肠杆菌分离株的遗传相关性分析对江苏某奶牛场分离到的17株产志贺毒素大肠杆菌基因组用Xba Ⅰ酶切后进行脉冲场凝胶电泳,通过UPGMA进行聚类分析绘制出系统进化树,并分析其遗传相关性。这17株STEC通过Xba Ⅰ酶切得到了17种不同的酶切图谱,相似指数在41.8%-90.3%之间,STEC 13和STEC 65, STEC 41和STEC 78的Dice相似系数高于80%,其他的菌株之间的Dice相似系数均未达到80%,这反映了该奶牛场所分离到的STEC亲缘性较低,具有丰富的克隆群,存在感染人类的潜在危险性。