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第一部分补阳还五汤对糖尿病周围神经病变大鼠感觉功能和背根神经节感觉神经元凋亡的影响目的:观察不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠感觉功能和背根神经节（DRG）感觉神经元凋亡的影响。方法:SD大鼠随机分为对照组（Control组）、DPN组、DPN加120g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW120组）、DPN加60g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW60组）、DPN加30g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW30组）、DPN加α-硫辛酸组（DPN+ALA组）。对照组给与标准饮食。其余各组腹腔注射链脲佐菌素（STZ）配合高糖高脂饲料喂养建立糖尿病模型。造模成功当天开始持续药物干预12周。DPN+BYHW120组、DPN+BYHW 60组、DPN+BYHW30组分别给与含120g黄芪、含60g黄芪和含30g黄芪的补阳还五汤中药免煎颗粒水溶剂灌胃;DPN+ALA组大鼠给与α-硫辛酸（ALA）灌胃;对照组和DPN组给与等体积的生理盐水。分别于药物干预后第4周、第8周、第12周测量各组血糖、体重。第12周处死大鼠前检测大鼠感觉神经传导速度、机械性痛阈,二者均减低者为DPN动物。取实验大鼠双侧L4-5背根神经节,经HE染色、甲苯胺蓝染色观察各组病理形态改变;用TUNEL法检测背根神经节感觉神经细胞DNA断裂损伤情况、免疫组织化学和Western blot法检测背根神经节内cleaved caspase-3表达情况。结果:1.血糖、体重变化糖尿病大鼠血糖持续保持在较高水平,各药物干预组血糖水平与DPN组比较无显著差异。各组实验大鼠体重无明显差异。2.感觉神经传导速度DPN组大鼠感觉神经传导速度显著低于对照组。DPN+ALA组、DPN+BYHW120组和DPN+BYHW60组感觉神经传导速度均高于DPN组。DPN+BYHW60组和DPN+BYHW30组感觉神经传导速度较DPN+BYHW120组降低。3.机械性痛阈DPN组大鼠机械性痛阈显著低于对照组。DPN+ALA组、DPN+BYHW120组和DPN+BYHW60组机械性痛阈高于DPN组。DPN+BYHW60组和DPN+BYHW30组机械性痛阈较DPN+BYHW120组降低。4.背根神经节病理形态学改变对照组DRG感觉神经元胞体中含大量Nissl体。DPN组Nissl体明显减少。DPN+ALA组和DPN+BYHW120组Nissl体较DPN组增多。5.背根神经节内神经元DNA损伤情况对照组未见TUNEL染色阳性细胞。DPN组可见大量阳性细胞。DPN+ALA组、DPN+BYHW120组和DPN+BYHW60组阳性细胞百分比均较DPN组下降。6.背根神经节内cleaved caspase-3表达情况Cleaved caspase-3在糖尿病大鼠神经元胞浆中有不同程度表达。Western blot结果显示:DPN组cleaved caspase-3较对照组相对表达增强,各用药干预组cleaved caspase-3相对表达均较DPN组降低。DPN+BYHW60组和DPN+BYHW30组cleaved caspase-3相对表达量高于DPN+BYHW120组。小结:补阳还五汤能够提高糖尿病周围神经病变大鼠感觉神经传导速度、降低其痛觉敏感性,减轻背根神经节内神经元病理损伤,减少神经元凋亡。其对DPN的治疗作用并不依赖于血糖控制。治疗效果与方中黄芪的用量有一定关系,120g黄芪剂量的补阳还五汤对糖尿病周围神经病的治疗效果较60g、30g黄芪剂量补阳还五汤更显著。第二部分补阳还五汤对糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节线粒体的影响目的:观察不同黄芪剂量补阳还五汤对DPN大鼠背根神经节线粒体结构和功能的影响。方法:SD大鼠随机分为对照组（Control组）、DPN组、DPN加120g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW120组）、DPN加60g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW60组）、DPN加30g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW30组）、DPN加α-硫辛酸组（DPN+ALA组）。对照组给与标准饮食。其余各组腹腔注射STZ配合高糖高脂饲料喂养建立糖尿病模型。造模成功当天开始持续药物干预12周。DPN+BYHW120组、DPN+BYHW 60组、DPN+BYHW30组分别给与含120g黄芪的补阳还五汤、含60g黄芪的补阳还五汤和含30g黄芪的补阳还五汤中药免煎颗粒水溶剂灌胃;DPN+ALA组大鼠给与ALA灌胃;对照组和DPN组给与等体积的生理盐水。药物干预12周后处死大鼠,取双侧L4-5背根神经节,透射电镜观察各组大鼠背根神经节内神经元线粒体形态结构;用比色法检测背根神经节呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,通过羰花青荧光染色定性、定量检测背根神经节线粒体膜电位。结果:1.各组背根神经节内神经元线粒体超微结构变化DPN组背根神经节神经元线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、稀疏甚至消失,多数呈空泡样改变。DPN+BYHW120组和DPN+ALA组背根神经节神经元线粒体微肿胀,结构相对完整,线粒体嵴较清晰,损伤程度明显减轻。DPN+BYHW60组、DPN+BYHW30组神经元线粒体肿胀,部分呈空泡样改变,线粒体嵴断裂。2.各组背根神经节呼吸链复合物活性变化DPN组呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均较对照组显著降低。与DPN组比较,DPN+BYHW120组和DPN+ALA组呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性升高。DPN+BYHW60组呼吸链复合物Ⅳ活性较DPN组升高。3.各组背根神经节线粒体膜电位变化DPN组线粒体膜电位较对照组显著降低,DPN+BYHW120组、DPN+ALA组线粒体膜电位较DPN组升高。DPN+BYHW30组线粒体膜电位低于DPN+BYHW120组。小结:背根神经节内神经元线粒体结构受损,呼吸链复合物活性降低和线粒体膜电位下降是DPN气虚血瘀的病理基础。补阳还五汤能够减轻糖尿病对大鼠背根神经节内神经元中线粒体的结构损害,提高呼吸链复合物活性和线粒体膜电位,减少线粒体生物能受损。补阳还五汤的线粒体保护作用与方中黄芪的用量有一定关系,120g黄芪剂量的补阳还五汤对DPN背根神经节线粒体的保护作用较60g和30g黄芪剂量补阳还五汤更明显。第三部分补阳还五汤通过SIRT1/p53途径对糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节线粒体依赖性细胞凋亡的影响目的:观察不同黄芪剂量补阳还五汤对DPN大鼠背根神经节SIRT/p53通路的影响方法:SD大鼠随机分为对照组（Control组）、DPN组、DPN加120g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW120组）、DPN加60g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW60组）、DPN加30g黄芪补阳还五汤组（DPN+BYHW30组）、DPN加α-硫辛酸组（DPN+ALA组）。对照组给与标准饮食。其余各组腹腔注射STZ配合高糖高脂饲料喂养建立糖尿病模型。造模成功当天开始持续药物干预12周。DPN+BYHW120组、DPN+BYHW 60组、DPN+BYHW30组分别给与含120g黄芪的补阳还五汤、含60g黄芪的补阳还五汤和含30g黄芪的补阳还五汤中药免煎颗粒水溶剂灌胃;DPN+ALA组大鼠给与ALA灌胃;对照组和DPN组给与等体积的生理盐水。药物干预12周后处死大鼠,取双侧L4-5背根神经节,用免疫组织化学法和免疫印迹法检测SIRT1、acetyl-p53、Drp1、BAX、BCL-2的表达,用RT-PCR法检测以上蛋白mRNA表达。结果:1.SIRT1/p53通路相关蛋白表达DPN组SIRT1表达较对照组显著降低,acetyl-p53、Drp1、BAX与BCL-2比值均较对照组升高。与DPN组比较,DPN+ALA组、DPN+BYHW120组SIRT1表达增高,药物治疗各组acetyl-p53、Drp1表达和BAX与BCL-2的比值均降低。与DPN+BYHW120组比较,DPN+BYHW60组的SIRT1表达降低,DPN+BYHW30组的acetyl-p53表达升高。2.SIRT1/p53通路相关蛋白mRNA表达与对照组比较,DPN组SIRT1 mRNA表达下调,p53、Drp1、BAX和BCL-2 mRNA表达增多。与DPN组比较,各药物治疗组SIRT1 mRNA表达增多,p53、Drp1、BAX mRNA表达减少;DPN+ALA组、DPN+BYHW120组BCL-2 mRNA表达升高。与DPN+BYHW120组比较DPN+BYHW60组和DPN+BYHW30组SIRT1 mRNA表达下调,DPN+BYHW30组Drp1、BAX mRNA表达升高。小结:p53介导的线粒体破坏诱导细胞凋亡是导致DPN发生的重要分子机制。补阳还五汤和ALA可上调DPN大鼠背根神经节内SIRT1表达,通过其脱乙酰作用,抑制p53介导的线粒体依赖性细胞凋亡。补阳还五汤对SIRT1/p53通路的调节作用与方中黄芪的用量有一定关系,120g黄芪剂量的补阳还五汤上调SIRT1,抑制p53依赖的细胞凋亡的作用较60g和30g黄芪剂量补阳还五汤更明显。第四部分黄芪甲苷通过SIRT1/p53通路对糖尿病周围神经病变大鼠背根神经节线粒体依赖性细胞凋亡的影响目的:研究黄芪甲苷（AS-Ⅳ）通过SIRT1/p53途径对DPN大鼠背根神经节线粒体依赖性细胞凋亡的影响。方法:高糖高脂饲料和腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠分为三组:DPN组,AS-Ⅳ组（60mg/kg/d）和α-硫辛酸（ALA）组（60mg/kg/d）。每4周监测体重和血糖水平,持续12周。检测机械性痛阈和神经传导速度,评估DPN。分离大鼠背根神经节,通过电镜观察线粒体的病理变化,检测线粒体呼吸链复合物的活性,线粒体膜电位。使用TUNEL试剂盒检测神经细胞凋亡。使用免疫组织化学和Western blot检测cleaved caspase-3,SIRT1/p53通路中主要蛋白,包括SIRT1,acetyl-p53,Drp1,BAX和BCL-2的表达。检测SIRT1/p53通路中主要蛋白的基因表达。结果:腹腔注射STZ大鼠血糖均显著升高。治疗12周后,AS-Ⅳ和ALA并未显著影响体重和空腹血糖水平,但减轻了DPN的异常疼痛并改善了神经传导速度。AS-Ⅳ和ALA均可减少线粒体损伤,提高线粒体电子运输链复合物活性和线粒体膜电位,并减少TUNEL染色阳性细胞百分比和cleaved caspase-3蛋白的表达。AS-Ⅳ和ALA上调SIRT1的表达,下调acetyl-p53,Drp1的表达以及BAX与BCL-2的比值。以上蛋白的mRNA表达也显示出类似的变化。小结:AS-Ⅳ和ALA均可通过调节SIRT1/p53抑制线粒体依赖性细胞凋亡,提高DPN大鼠的神经传导速度和机械性痛阈,对DPN有类似的治疗效果。结论1.p53介导的线粒体依赖性细胞凋亡是DPN的重要发病机制。2.背根神经节线粒体结构受损,呼吸链复合物活性降低和膜电位下降是DPN气虚血瘀的病理基础。3.补阳还五汤调节SIRT1/p53通路减少线粒体依赖性细胞凋亡,提高线粒体质量,保护神经功能,对DPN有治疗作用。4.补阳还五汤对DPN的治疗作用与方中黄芪的用量有一定关系,120g黄芪用量的补阳还五汤的神经保护作用较60g和30g黄芪剂量补阳还五汤更明显。5.黄芪甲苷作为补阳还五汤中最主要的成分,可调节SIRT1/p53通路减少线粒体依赖性细胞凋亡,对DPN有与ALA类似的治疗效果。