研究背景各种原因所致的肝功能衰竭严重威胁着人类健康,原位肝移植由于费用昂贵、供体短缺限制其在临床的应用。生物人工肝支持系统借助体外装置暂时替代肝脏功能,直至自体肝脏功能恢复或进行肝移植,是目前肝衰竭治疗研究的热点之一。肝细胞是生物人工肝支持系统的核心部分,从生物工程学角度讲,用于生物人工肝的理想肝细胞要人源性、表型正常,容易获得和培养,能在体外迅速生长增殖至高密度,保持良好的分化状态,具有成熟肝细胞的所有生物代谢功能。由于人原代肝细胞存在体外培养条件苛刻、存活时间有限、增殖传代困难及来源短缺等问题,因此,构建一个增殖能力强且具备良好分化功能的人肝细胞系对生物人工肝的发展是至关重要的。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的激活是细胞永生化的重要步骤。通过转入外源性基因hTERT到端粒酶阴性细胞中可以恢复目的细胞端粒酶的活性,使细胞的端粒长度得到修复和保持,进而延长细胞在体外培养条件下的寿命,甚至发展为永生化。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶,处于凋亡级联反应通路的核心位置,是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。借助siRNA技术手段沉默Caspase-3的表达,有可能通过慢病毒载体转染人原代肝细胞,所构建的永生化人肝细胞在基因组的保真性和稳定性、细胞的合成代谢功能方面均具有较好的优势。本研究采用细胞永生化和抗调亡原理,应用基因克隆、RNAi干扰、慢病毒表达载体等技术构建hTERT基因与Caspase-3RNAi两个慢病毒载体,利用慢病毒表达载体对原代培养的正常人肝细胞稳定转染人端粒酶逆转录酶基因和抑制Caspase-3表达的siRNA,建立永生化人肝细胞株HepGL,并对其生物学特性及某些功能进行研究,评价其作为生物人工肝种子细胞的可行性。全文共分五章：第一章慢病毒载体pLENT6.3/V5-hTERT-IRES-RFP的构建目的：利用慢病毒载体构建携带有目的基因人端粒酶逆转录酶（hTERT）和标记基因红色荧光蛋白（RFP）的真核表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,为基因转染人原代肝细胞奠定实验基础。方法：①慢病毒phTERT-IRES-RFP的构建和鉴定：PCR扩增hTERT基因并克隆入pIRES-RFP载体,通过BglⅡ和EcoRI酶切,克隆入pIRES-RFP载体的BglⅡ和EcoRI位点之间。PCR产物经纯化、酶切后胶回收,以质粒pIRES-RFP为模板,通过载体酶切,T4-DNA连接酶反应。将连接产物转化大肠杆菌DH5a,卡那霉素筛选,挑取阳性克隆行PCR、酶切及测序验证phTERT-IRES-RFP质粒。②pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重组载体的构建和鉴定：PCR扩增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体,通过用BglⅡ和Nhel酶切,克隆入pLenti6.3-MCS-V5载体的BamHI和NheⅠ位点之间。PCR产物经纯化、酶切后胶回收,以pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体为模板,通过载体酶切,T4-DNA连接酶反应。将连接产物转化入大肠杆菌STB13感受态,挑取单菌落扩增培养,提取质粒,并进行测序证实pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP载体。③含hTERT-RFP病毒颗粒上清的包装和收集：利用脂质体转染法将慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP、包装质粒（含pLP1, pLP2和pLP/VSVG三个质粒）共转染293FT细胞,包装收集病毒,浓缩,滴度测定。结果：①慢病毒phTERT-IRES-RFP的构建和鉴定结果：本实验成功扩增长达约3.4Kbp的hTERT片段,行PCR,酶切及测序鉴定,证实hTERT已克隆入pIRES-RFP载体,并成功获得phTERT-IRES-RFP产物。②LENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重组载体的构建和鉴定结果：经PCR扩增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒载体构建得慢病毒重组质粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,将重组质粒测序,证实重组质粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP构建成功。③含hTERT-RFP病毒颗粒上清液的制备结果：将pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP与包装质粒共转染293FT细胞,终止转染72h后收集上清液,即得含hTERT-RFP病毒颗粒的上清液。根据滴度计算公式计算得到慢病毒的滴度为5.88x106TU/mL结论：成功利用慢病毒载体构建携带hTERT基因的真核表达载体pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP。第二章Caspase-3siRNA慢病毒载体的构建目的：构建针对目的基因Caspase-3序列表达的RNAi DNA质粒载体,并筛选出有效的干扰靶点并进行慢病毒载体包装。方法：①siRNA干扰载体的构建：针对目的基因caspase-3基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4对siRNA干扰靶点序列,分别为SR₁SR₂SR₃、SR₄, SR_neg （C-）为阴性对照,将4对双链的siRNA oligo分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α。用载体通用引物进行菌落PCR筛选得到的阳性克隆进行测序,验证重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,扩增质粒备用。②iRNA干扰载体的转染与筛选：应用干扰质粒瞬时转染处于对数生长期的HEK293细胞,24h后观察荧光表达情况；运用qPCR和Weatern Blot检测各干扰质粒在基因和蛋白水平对目的蛋白的抑制水平。根据qPCR的结果,pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-SR₂瞬时转染后,对目的基因的抑制效果最为明显。③慢病毒表达载体构建、包装：应用Gateway重组技术构建慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-SR₂。经过比对,重组的慢病毒载体中oligo序列完全正确。慢病毒载体的构建成功,扩增质粒备用；利用慢病毒包装细胞293FT细胞,包装病毒,测定滴度。所得实验数据用均数±标准差（x±SD）表示,取检验性显著水准a=0.05,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,采用One-Way ANOVA对实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析,样本方差齐性时选用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时则选用Tamhane’s T2法进行比较。结果：①设计4个干扰靶点,分别为分别为SR₁、SR₂、SR₃、SR₄, SR_neg（C-）为阴性对照,并与siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR成功连接,构建4个siRNA表达质粒质粒成功连接；②经过测序对比,构建的4个针对caspase-3的RNAi质粒载体成功,并成功扩增和抽提；③经过qPCR检测,单因素方差分析显示,4个siRNA转染显著地影响了HEK293细胞中Caspase-3表达(Welch=27965.102,组间多重比较（Tamhane’s T2法）结果显示：siRNA2转染HEK293细胞后Caspase-3mRNA相对表达量为（9.84±0.461,P<0.001）,对目的基因的抑制效果最为明显。④使用Gateway重组技术构建慢病毒表达载体pLENT6.3/V5-SR₂检测测序序列完全正确,慢病毒载体的构建成功。⑤慢病毒的经包装后滴度测定为3.6x105TU/ml。结论：成功构建针对Caspase-3基因的siRNA慢病毒载体。第三章人原代肝细胞分离培养目的：建立人原代肝细胞体外分离方法。方法：采用多点穿刺灌注的方法,将预温38℃的前灌流液以及Ⅱ型胶原酶溶液灌注入人肝脏组织中,经过消化及离心后获得人原代肝细胞；倒置显微镜和电镜观察细胞形态特征,并进行鉴定：台盼蓝及吖啶橙／碘化丙啶染色鉴定细胞活力,PAS （periodicacid-Schiff, PAS）染色观察细胞肝糖元的含量,免疫细胞化学鉴定肝细胞ALB表达。结果：平均大小为3cm×2cm×1cm的肝组织块经多点穿刺灌注法消化分离后,可获得约5×105个肝细胞,分离获得的细胞活率达90%；细胞培养24小时后呈铺路石样生长,无增殖现象,电镜示肝细胞呈典型的细胞核大,胞质少；培养的肝细胞PAS糖原染色阳性；ALB表达阳性。结论：多点穿刺灌注法分离人原代肝细胞,方法简单易行,且肝细胞产量高、活力好、纯度高,培养的肝细胞具有特异性生物学功能表达,适宜在一般条件实验室推广应用。第四章永生化人肝细胞株的建立及鉴定目的：研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因和Caspase-3siRNA异时先后转染人原代肝细胞构建永生化人肝细胞株HepGL并进行形态和功能学鉴定。方法：将表达h-TERT基因的重组慢病毒感染人原代肝细胞,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆,获得HepGL-H肝细胞；用含Caspase-3-siRNA的慢病毒液感染HepGL-H细胞构建永生化人肝细胞HepGL,并分别通过倒置相差显微镜动态观察转染前后肝细胞形态变化及生长增殖情况；PAS （peri odicacid-Schiff, PAS）染色观察细胞肝糖元的含量,免疫细胞化学鉴定肝细胞ALB表达。分析其染色体核型;RT-PCR测定其相关功能基因和表面标志基因表达；通过全自动生化分析仪测定HepGL细胞培养上清中ALT.AST.尿素浓度变化；绘制HepGL细胞生长曲线。结果：所建立的永生化人肝细胞株HepGL具有原代肝细胞的典型形态特征,而且具有较好的增殖能力,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常；RT-PCR检测HepGL表达hTERT.P4503A.albumin.ASGPR.GS.GST-π兀.HBCF-X.HNF4. CK18mRNA的肝细胞生物学特性；全自动生化分析仪测定HepGL细胞培养上清中ALT、AST浓度随着培养时间的延长呈递减趋势,尿素则呈逐渐递增趋势。结论：本研究建立的永生化人肝细胞株HepGL具有与原代肝细胞类似的形态特征和生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中理想的种子细胞材料。第五章永生化人肝细胞株的安全性研究目的：探讨永生化人肝细胞株HepGL有无致瘤性。方法：实验分为HepGL组和C3A组两组,按随机数目表法完全随机分配,每组裸鼠10只。两组分别在裸鼠的颈部、后背部皮下以0.2ml,2.0×106个HepGL和C3A细胞,观察皮下组织致瘤情况。每天测量瘤体大小,5周后切取注射部位瘤组织及脑、肝、肺、肾组织标本。结果：HepGL组未见接种部位出现种植瘤,组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别,肝、肺、脑、肾组织切片无转移。C3A组共有20个接种部位出现肿瘤,致瘤率为100%,裸鼠皮下种植瘤细胞形态大小均一,细胞核深染,核分裂相较多,细胞呈梁状排列。结论：永生化人肝细胞株HepGL无致瘤性,具备良好的应用安全性。