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目的通过设计体内外的实验模型,借助光动力的杀伤原理来探索血卟啉注射液喜泊分（HpD）介导的光动力（PDT）治疗4T1小鼠乳腺癌细胞后,发生的原位细胞的死亡效应及其自噬反应。借助细胞部分以及荷瘤小鼠两部分的研究内容,对比在体、离体情况下,光动力引发肿瘤细胞的杀伤、自噬的强弱,对自噬关键基因Beclin-1、LC3以及关键蛋白Beclin-1、LC3、P62的检测,确定自噬发生的时间以及程度,并借助设计不同能量的实验组来进一步探索光动力剂量与自噬强弱及自噬出现时间的关系。方法一、培养4T1小鼠乳腺癌细胞,设计实验分组,通过CCK8实验证明单纯添加光敏剂及单纯630nm激光照射的单因素组与空白对照组的实验结果,彼此之间无统计学差异。光敏剂喜泊分（HpD）浓度选择为1.5ug/ml,结合文献报道以及前期实验摸索,照光的功率密度为10mw/cm~2,实验分组设置为:空白对照组、光敏剂加照光（1J/cm~2）、光敏剂加照光组（4J/cm~2）。来观测肿瘤细胞死亡率与能量之间的关系,进一步使用60mm的培养皿进行细胞的分组处理后,分别在3h、6h、12h进行收集细胞,使用RT-PCR检测自噬相关基因,Western Blot检测自噬相关蛋白,来分析自噬出现的时间、程度以及与光动力治疗剂量的关系。二、建立Balb/c小鼠乳腺癌模型,设计实验分组,浓度为8×10~5个/ml的4T1乳腺癌细胞悬液来进行荷瘤小鼠模型的构建。模型构建成功后进行实验分组,分为空白对照组、40J/cm~2、100J/cm~2三组,保证肿瘤原始大小组间无差异,实验组的小鼠尾静脉注射100u l浓度为1mg/ml的HpD,对照组不作处理,光敏剂在体48h后进行照光处理,固定功率密度为100mw/cm~2,照光时间分别为400s和1000s。处理后的小鼠进行生存曲线以及生长曲线的绘制。采取同样的建模方式,在12h、24h、48h对各组小鼠进行取材,将取出的肿瘤组织制成石蜡切片,进行HE染色,显微镜下观察不同组之间肿瘤细胞的形态学差异,TUNEL染色观察肿瘤细胞的凋亡水平。三、建立Balb/c小鼠乳腺癌模型,方法同前,然后通过使用RT-PCR检测自噬相关基因,Western Blot检测自噬相关蛋白,借助数据分析软件来定量分析自噬与光动力治疗剂量之间的关系。结果1、在细胞水平,Beclin-1在4J/cm~2组在3h与6h相对于同时间段的对照组的具有统计学的差异,1J/cm~2在12h相高于6h,并且有统计学的差异,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在1J/cm~2与4J/cm~2组内从3h均有升高,并且升高的趋势和能量密度正相关,实验组在6h与对照组相比对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ依然升高并且都具有显著的统计学差异,随后到12h实验组均低于对照组,而在组内可以看出1J/cm~2在整个时间段里的表现是3h到6h升高,6h到12h降低,而4J/cm~2组则是在3h就表现出明显的升高,随后逐渐降低。2、40J/cm~2的原位的直接杀伤作用不如100J/cm~2但是远期的抑瘤效果更优,免疫组化等结果显示原位杀伤作用和能量密度呈正相关,并且出现的时间也有相关性。3、自噬的相关基因100J/cm~2组的Beclin-1在12h高于对照组,并且随后出现下降的趋势,而40J/cm~2组则在24h高于对照组,随后也出现下降趋势,能量密度高引发自噬的时间越早,而LC3的表达相对更晚,蛋白Beclin-1在40J/cm~2组12h的表达水平明显高于对照组并且随着时间而逐渐减低,100J/cm~2的表达情况也类似。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的整体表达情况更能反映自噬的强弱,40J/cm~2组在12h已经出现自噬反应,在24h自噬水平升高后到48小时降低,而100J/cm~2组则在12h后呈现逐渐降低,在100J/cm~2自噬被激发的时间更早,作用效果更强。结论不同能量密度对肿瘤细胞的杀伤作用存在差异,细胞的死亡比例随能量密度的升高而升高,PDT激发了细胞的自噬,自噬相关基因的表达增强,关键蛋白的表达量增加,促进自噬小体的生成,完成自噬,而不同的能量刺激下,自噬的程度有所差异。4J/cm~2组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值,在3h表现出升高的趋势,并在6h上升,12h下降。1J/cm~2组中肿瘤细胞的自噬在6h表现高峰。自噬升高的趋势以及发生时间和能量密度相关。荷瘤小鼠模型中PDT对原位肿瘤的杀伤作用随着能量的增加而增强,但是从长期的抑瘤作用以及荷瘤小鼠生存时间来看,40J/cm~2组可能因为诱发了免疫反应要优于100J/cm~2组,免疫组化以及TUNEL的结果也可以看出杀伤作用和能量呈正相关,100J/cm~2组要早于40J/cm~2组;从自噬相关基因的表达倍增来看,100J/cm~2组要早于40J/cm~2组;结合关键蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的变达情况,PDT治疗后肿瘤组织内的自噬在12h升高24h达到相应的峰值后出现下降的趋势。