第一部分体外实验钙离子依赖的内质网应激信号通路在大鼠髁突软骨细胞中的体外研究[目的]研究钙离子依赖的ERS信号通路在体外培养大鼠髁突软骨细胞中的作用。[方法]选取3周龄的SD大鼠,取颞下颌关节髁突软骨进行原代培养,采用第三代髁突软骨细胞进行实验。用常见的ERS诱导剂4 μg/ml衣霉素(Tunicamycin, Tm)处理大鼠髁突软骨细胞,或用钙离子通道受体阻断剂2-APB、Rya,2-APB+Rya预处理30min后再加入4 μg/ml Tm,处理24h后收集细胞。实验分为：空白对照组、Tm组、Tm+2APB组、Tm+Rya组、Tm+2APB+Rya组。采用Fura-2/AM荧光染料进行胞浆内钙离子染色,然后用荧光光谱仪检测细胞内钙离子浓度的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率；采用RT-qPCR和Western Blot检测GRP78.GRP94、 CHOP、Caspase-12内质网应激标志分子在nRNA和蛋白水平的表达改变。[结果]1.Tm处理大鼠髁突软骨细胞24小时后,细胞钙离子浓度显著升高(P<0.05)。经钙离子通道受体阻断剂预处理后,细胞内钙离子浓度显著降低(Tm+2APB+Rya组>Tm+Rya组>Tm+2APB组),但仍高于空白对照组。而单纯用钙离子通道受体阻断剂处理后与空白对照组无显著差异。2.Tm处理大鼠髁突软骨细胞24小时后,细胞有明显凋亡增加(P<0.01),而经钙离子通道受体阻断剂预处理后,凋亡显著减少(P<0.01),与空白对照组无显著差异。3.Tm处理大鼠髁突软骨细胞24小时后,ERS标志分子GRP78、GRP94、CHOP、 Caspase-12 mRNA及其蛋白水平上表达升高。钙离子通道受体阻断剂可以抑制Tm诱导的大鼠髁突软骨细胞(GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12 mRNA及其蛋白水平上表达升高,除Caspase-12,均以2APB+Rya效果佳。[结论]1.Tm可以诱导大鼠髁突软骨细胞发生ERS,导致细胞凋亡。2.Tm可以使大鼠髁突软骨细胞内钙离子浓度升高。3.钙离子通道受体阻断剂可以抑制大鼠髁突软骨细胞发生ERS,降低相应的内质网应激蛋白分子表达,从而对Tm诱导的大鼠髁突软骨细胞的凋亡起保护作用。第二部分体内实验钙离子依赖的内质网应激信号通路在压力刺激下大鼠髁突软骨病理变化过程中的作用及其机制研究[目的]观察钙离子阻断剂及压力作用下大鼠髁突软骨组织形态学、超微结构以及凋亡活性变化,以及ERS相关蛋白GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12表达的改变,探讨钙离子信号依赖的内质网信号通路在大鼠髁突软骨病理变化过程中的作用及其机制。[方法]选择6周龄SD雄性大鼠90只,用本课题组自主设计的颞下颌关节压应力加载的动物模型装置(专利号：201120210396.4),对大鼠髁突软骨施加向上、向后的80g/侧超负荷压应力刺激诱导大鼠髁突软骨发生内质网应激,设为空白对照组、MF(mechanical force)组、MF+2APB组、MF+Rya组、MF+2APB+Rya组,加力时间为3天和7天组。采用GENMED组织钙离子浓度比色法定量检测大鼠髁突软骨组织钙离子浓度的变化；苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠髁突软骨层厚度及形态学的变化；透射电镜观察大鼠髁突软骨细胞内质网超微结构的变化；TUNEL荧光染色观察大鼠髁突软骨细胞凋亡的变化；免疫组化(immunohistochemistry, IHC)检测内质网应激标志分子GRP78、GRP94. Caspase-12的表达改变。[结果]压力加载后大鼠髁突软骨中的钙离子浓度升高,随时间的延长,浓度逐渐增加。在重力加载下,HE切片染色显示大鼠髁突软骨层厚度变薄,髁突软骨细胞出现内质网扩张和空泡性改变；细胞凋亡在3天组出现增加。IHC结果显示大鼠髁突软骨细胞内内质网应激标志分子GRP78、GRP94, Caspase-12的表达明显升高。而当关节腔注射钙离子通道受体阻断剂后,可以抑制上述情况的发生,且2-APB+Rya组要依次优于Rya组和2-APB组,单纯加药组与空白对照在上述各项中无显著差异。[结论]钙离子依赖的内质网应激信号通路在大鼠髁突软骨病理变化过程起着重要作用,钙离子通道受体阻断剂可以降低髁突软骨组织钙离子浓度,缓解大鼠髁突软骨的变薄效应,抑制大鼠髁突软骨细胞发生凋亡。钙离子通道受体阻断剂可以通过降低大鼠髁突细胞内ERS标志分子的表达来缓解持续的内质网应激反应,从而对大鼠髁突软骨起着保护作用。