[目的]探讨TET蛋白介导的羟甲基化表观遗传学修饰异常与激素性股骨头坏死的关系;明确TET1、TET2和TET3在激素性股骨头坏死发病中的作用;探讨糖皮质激素诱导的TET-5hmC下游信号通路改变;体外降表达TET3后观察其对于糖皮质激素诱导的骨细胞凋亡和Akt信号通路的影响;体内降表达TET3后观察其对于激素性股骨头坏死发生发展的作用。[方法]第一部分:收集6例激素性股骨头坏死与6例股骨颈骨折患者股骨头标本,采集患者基本信息与影像学资料。TUNEL凋亡染色比较二者骨细胞凋亡的变化;实时荧光定量PCR检测TET1、TET2和TET3的mRNA表达情况;Western Blotting检测TET3的蛋白表达变化;Dot Blotting检测5hmC富集水平的改变。第二部分:不同剂量地塞米松干预MLO-Y4骨样细胞或相同剂量干预不同时间,TUNEL凋亡染色检测细胞凋亡情况;CCK8检测活细胞数量变化;台盼蓝染色评价细胞死亡情况;Edu染色评价细胞增殖核酸复制情况;Western Blotting检测凋亡相关的Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3以及TET1、TET2和TET3的表达水平;亚细胞分离检测细胞核蛋白中TET3的变化水平;免疫荧光染色和Dot Blotting检测基因组5hmC富集水平改变。进行hMeDIP-chip检测,分析糖皮质激素诱导的5hmC动态变化影响的下游信号通路,生物信息学分析预测Akt信号通路与地塞米松诱导的表观遗传学调控密切相关,使用Akt信号通路激活剂bpV(phen)预处理MLO-Y4细胞,检测其对于地塞米松诱导骨细胞凋亡的影响;另外,进一步检测p-Akt、总Akt、PTEN、p-PI3K、PI3K、Bcl-2、Bax以及Cleaved Caspase-3蛋白在激素性股骨头坏死临床标本中的表达变化。使用siRNA分别敲低TET1、TET2和TET3的表达水平,分析其对于地塞米松诱导骨细胞凋亡的影响;降表达TET3后,亚细胞分离检测细胞总蛋白和核蛋白中TET3的变化趋势,并检测5hmC的含量;同时评价Akt信号通路活性改变。第三部分:皮下注射甲强龙琥珀酸钠(21mg/kg·d)建立SD大鼠激素性股骨头坏死动物模型,髓腔注射投递TET3 siRNA体内转染复合物。造模28天,于第1天和第15天进行TET3 siRNA体内转染。造模完成后,活体麻醉状态下行核磁扫描,观察大鼠股骨头T1加权像和T2加权像信号改变(n=6)。麻醉处死大鼠取出双侧股骨头。左侧股骨头行Micro-CT扫描,分析股骨头骨骺远端感兴趣区内骨小梁微结构改变(n=6);Micro-CT扫描完成后行组织形态学染色,评价空骨陷窝和骨髓腔内脂肪空泡数量,观察骨小梁结构改变(n=6);TUNEL凋亡染色评价骨细胞凋亡情况(n=6);右侧股骨头平均分为两部分,一部分检测TET1、TET2和TET3的蛋白表达变化(n=4);另一部分检测基因组5hmC水平变化(n=4)。[结果]第一部分:6例激素性股骨头坏死患者年龄66.2±6.6岁(59-77岁),4名男性,2名女性;6例股骨颈骨折患者年龄76.2±5.5岁(68-85岁),3名男性,3名女性。股骨头石蜡切片TUNEL染色结果显示激素性股骨头坏死组骨细胞凋亡为30.14±3.73%(20-46.67%),股骨颈骨折组骨细胞凋亡百分率为9.47±1.21%(5.26-11.76%);实时荧光定量PCR结果显示激素性坏死组TET3的mRNA水平显著增加,但TET1和TET2无显著变化;Western Blotting结果显示TET3蛋白水平在激素性坏死组显著增加;Dot blotting发现5hmC在激素性坏死的水平明显升高。第二部分:体外实验表明地塞米松作用于MLO-Y4细胞使其凋亡呈时间依赖性和剂量依赖性增加。10-6M的地塞米松作用于MLO-Y4细胞8h和12h使其凋亡显著增加、活细胞数量显著减少、死细胞数量显著增加、细胞增殖核酸复制明显减弱,但10-6M的地塞米松作用2h和4h无显著性影响(10-6M的地塞米松作用4h时细胞增殖核酸复制减弱,2h时无明显作用);10-6M和10-5M地塞米松作用于MLO-Y4细胞12h使其凋亡显著增加、活细胞数量显著减少、死细胞数量显著增加、细胞增殖核酸复制明显减弱,但10-8M和10-7M的地塞米松作用12h无显著性影响;探讨其内在机制,地塞米松是通过上调Bax/Bcl-2蛋白表达比例、促进Cleaved Caspase-3的激活从而诱导MLO-Y4细胞凋亡;进一步探讨地塞米松对于MLO-Y4细胞表观遗传学调控的影响,发现5hmC水平随着地塞米松作用时间延长而逐渐升高;mRNA水平检测显示地塞米松能够调控TET1和TET3的表达,尤其是TET3的表达水平与地塞米松之间存在时间依赖性关系;蛋白水平检测进一步验证了TET3可能与糖皮质激素诱导MLO-Y4细胞凋亡有关,亚细胞分离表明地塞米松能够诱导TET3入核,提示TET3可能参与调控地塞米松诱导的5hmC表观修饰异常及下游的细胞凋亡反应。hMeDIP-chip结果显示5hmC随着地塞米松作用呈现动态变化趋势,GO分析表明差异基因主要与细胞发育、定位、代谢调控、分化、生物合成及细胞通讯有关,KEGG信号通路分析显示差异基因主要与PI3K-Akt、Notch、AMPK、Apoptosis、VEGF和Wnt信号通路有关;PI3K-Akt信号通路中Ppp2r5d、PTEN和JAK3的mRNA水平均在地塞米松作用后表达升高,PIK3r5、PIK3cd、TCL1和PDK2的mRNA水平均表达下降;PTEN的蛋白表达水平在地塞米松干预后显著上升,引起p-Akt水平下降;有意义的是,使用Akt信号通路激活剂bpV(phen)能够显著抑制地塞米松诱导的MLO-Y4细胞凋亡,同时能够逆转Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3的变化;激素性股骨头坏死临床标本验证Akt相关通路蛋白表达水平改变,PTEN表达显著升高,p-PI3K、p-Akt表达显著下降,凋亡相关的Bax/Bcl-2比例及Cleaved Caspase-3水平显著升高;使用siRNA降表达TET3后能够明显抑制地塞米松诱导的MLO-Y4细胞凋亡,但降表达TET1和TET2无明显作用;同时,敲低TET3后地塞米松诱导的5hmC水平上调被明显抑制,Akt信号通路中PTEN蛋白表达水平显著下降,p-Akt水平明显升高。第三部分:股骨头远端髓腔注射TET3 siRNA体内转染复合物能够显著抑制股骨头组织TET3的蛋白表达水平,但对TET1和TET2的表达无明显影响;同时组织的5hmC水平也显著下降,这说明TET3 siRNA体内转染的方法能够明显抑制糖皮质激素引起的5hmC表观修饰改变。股骨头组织形态学HE染色显示激素性坏死组出现大量空骨陷窝和骨髓腔内脂肪空泡,敲低TET3蛋白表达后空骨陷窝和骨髓腔内脂肪空泡明显减少;同时降表达TET3能够显著抑制股骨头组织的骨细胞凋亡;Micro-CT结果表明敲低TET3抑制激素性股骨头坏死过程中的骨小梁形态结构异常;MRI扫描显示降表达TET3后股骨头异常信号改变明显恢复。[结论]1.TET1、TET2和TET3均在骨组织中有明显表达,其中TET3在激素性股骨头坏死临床标本中显著升高,伴随着表观遗传学标志物5hmC水平的上调;2.糖皮质激素地塞米松能够诱导MLO-Y4骨样细胞凋亡,TET3-5hmC信号在其中发挥关键作用;3.hMeDIP-chip结果显示地塞米松诱导的羟甲基化表观调控与PI3K-Akt通路密切相关。敲低TET3后能够明显改变Akt信号通路活性及MLO-Y4细胞凋亡状态,说明TET3介导的5hmC表观修饰改变能够调控Akt信号从而作用于骨细胞凋亡过程,这一级联反应在激素性股骨头坏死过程中发挥重要作用;4.在动物模型中降表达TET3能够明显抑制激素性股骨头坏死过程中骨细胞凋亡、骨组织形态学异常改变、骨小梁微结构破坏及股骨头核磁信号异常改变,这说明TET3可能是治疗激素性股骨头坏死的新的靶点。