[目的]　　 周围神经损伤及继发的神经缺损，是临床常见的致残性疾病，是周围神经外科的临床难题。近年来组织工程化神经的研究取得突破性进展，为解决这一难题带来了希望。但目前的研究多局限于低级动物实验，离实际临床应用尚有一定距离。　　 本课题是在本课题组研究基础上，结合组织工程化神经种子细胞的研究进展和细胞移植的免疫学研究进展，在去细胞神经材料内植入自体或同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)，制备相应尺寸的组织工程化神经移植体来修复猕猴外周神经缺损，对该种组织工程化神经进行临床试验前评价，并对BMSCs促神经再生机制，和同种异体BMSCs用作组织工程化神经种子细胞进行初步探讨，为临床上解决修复长段外周神经缺损的难题提供研究基础。　　 [方法]　　 1.自体间充质干细胞植入去细胞神经支架修复猕猴40mm尺神经缺损的实验研究　　 1.1.猕猴BMSCs的分离、培养、纯化、扩增及鉴定：猕猴麻醉后，于髂前或髂后上棘用12号骨穿针穿刺抽取骨髓，用ficoll-paque密度梯度离心分离，取单核细胞层界面细胞培养、传代、纯化及扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。　　 1.2.猕猴许旺细胞的分离、培养、纯化、扩增及鉴定：取预变性7d腓总神经，应用双酶消化法和差速贴壁法分离提纯许旺细胞(SCs)培养、传代、纯化及扩增。SP法作S-100蛋白的免疫细胞化学鉴定。　　 1.3.化学萃取法制备猕猴去细胞神经支架及检测：依次用蒸馏水、3％Triton X-100和4％脱氧胆酸钠处理所取同种异体神经，然后进行HE染色、LN和Co1 I免疫组织化学染色、扫描电镜和透射电镜检测。　　 1.4.自体BMSCs、SCs与去细胞同种异体神经体外复合：取第3代BMSCs(或第2代SCs)，制成密度为1×10Scells/ml细胞悬液，显微注射到去细胞神经支架。HE染色观察移植细胞在支架内迁移和增殖。　　 1.5.神经移植体桥接猕猴40mm尺神经缺损。　　 2.同种异体间充质干细胞植入去细胞神经支架构建猕猴组织工程化神经移植体的初期研究　　 2.1.BMSCs分离、培养、纯化、扩增。　　 2.2.BMSCs的鉴定。　　 2.3.去细胞神经支架的制备及检测。　　 2.4.组织配型:4只雄性恒河猴与4只雌性恒河猴随机配对，取外周血，进行淋巴细胞混合反应(CCK8法)。　　 2.5.细胞标记及体外示踪研究:取P3的BMSCs，在PKH26工作液中孵育3～5分钟后，加入10％FBS终止反应，标记后3d和7d流式细胞仪检测BMSCs的荧光标记率，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察。　　 将PKH26标记好的BMSCs(浓度为107个/ml)细胞悬液显微注射到已制备的去细胞神经支架内，体外培养不同时间的样本行冰冻切片，DAPI复染，荧光显微镜下观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况。　　 2.6神经移植体桥接猕猴20mm桡神经缺损。　　 2.7 Real time RT-PCR检测NGF-mRNA及GDNF-mRNA:体外培养P3和P5 BMSCs，Real time RT-PCR检测其NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平；取植入BMSCs的去细胞神经移植体体外培养第3、7、14d神经移植体标本，Real time RT-PCR检测其NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平；术后2M取各神经移植体中间相同部位组织标本，Real time RT-PCR检测其NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平。　　 [结果]　　 第一部分结果　　 1.经密度梯度离心分离，体外培养纯化的猕猴BMSCs能很好地贴附生长增殖，可以在体外短时间大量扩增，细胞均一性高，以梭形细胞为主，传代增殖能力强。P3猕猴BMSCs的表达BMSCs的表面标志(CD29、CD105、CD166阳性)；而不表达造血干细胞的表面标志(CD34、CD80、CD86、CD71阴性)。　　 2.双酶消化法及差速贴壁法分离提纯许旺细胞，呈双极梭形，有两个细长的突起，细胞核呈圆形透亮区位于胞体一侧。第二代SCs的纯度达92％。　　 3.化学萃取后的同种异体神经呈乳白色，半透明，质地稍疏松。HE染色、LN和Col I免疫组织化学染色、扫描电镜和透射电镜检测发现去细胞神经保留了天然神经的空间结构、基底膜和胶原纤维结构，去除了细胞、轴突和髓鞘成分。　　 4.神经移植体修复猕猴尺神经40mm缺损术后，术后切口疤痕外观各组无差别。术后lM，所有实验肢体均可见小鱼际处蜕皮现象，小鱼际肌明显萎缩；术后6M，BMSCs-laden组、SCs-laden组及Autograft组小鱼际处蜕皮现象消失，小鱼际肌萎缩明显改善，小鱼际部恢复饱满。术后6M取材时，所有神经移植体表面均有不同程度的血管化，与周围组织无明显粘连，神经吻合口连续性良好，未见神经瘤形成。5.术后6M，神经电生理结果显示:BMSCs-laden组、SCMaden组及Autograft组的最短潜伏期、最大波幅、神经传导速度组间无差异，但均与non-cell-laden组有差异。6.术后6M，组织学检测显示:BMSCs-laden组、SCs-laden组及.Autograft组再生神经纤维数量无明显差异，但均优于non-cell-laden组。　　 第二部分结果　　 1.P3猕猴BMSCs表达CD29、CD166、CD44、CD106、CD105(SH2)；而不表达CD14、CD45、CD80、CD86、CD34、HLA-DR(MHC-II)、CD117、CD71。具有成骨、成脂分化能力。　　 2.PKH26标记BMSCs标记率高，标记后对细胞生物学活性无明显影响。　　 3.体外培养环境下，PKH26标记的BMSCs能在去细胞同种异体神经支架内增殖、迁移。体外培养28d，DAPI复染，支架内有较多有活性的BMSCs，同时可见许多凋亡的BMSCs。　　 4.植入PKH26标记的同种异体BMSCs的去细胞神经植入猕猴体内28d，可检测到标记的有活性的BMSCs和凋亡的BMSCs。　　 5.血清IFN-γ与IL-4水平均于神经移植术后3d开始升高，7d达高峰，14d开始下降，28d恢复到术前水平。allogenic-BMSCs-laden组与autogeneic-BMSCs-laden组间同时间段比较血清IFN-γ与IL-4水平均无显著差异。　　 6.术后2M，组织学检测发现各组均可见再生的神经纤维，non-cell-laden组再生神经纤维最少，余三组无明显差异。　　 7.术后2M，各神经移植体内均可见CD3+、CD68+和CD163+细胞浸润，aUogenic-BMSCs-laden组与autogeneic-BMSCs-laden组间比较CD3+、CD68+和CD163+细胞分布及数量无明显差异。　　 8. Real time RT-PCR检测体外培养的P3 BMSCs的NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平均高于P5 BMSCs，二者之间有显著差异性。体外培养3d的植入BMSCs的去细胞神经支架NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平最高，随体外培养时间延长而显著性降低。术后2M不同神经移植体的NGF-mRNA及GDNF-mRNA表达水平从高到低依次为 Autograft组、autogeneic-BMSCs-laden组、allogenic-BMSCs-laden组、non-cell-laden组，但前三组之间比较无明显差异，它们均与non-cell-laden组有显著差异。　　 [结论]　　 1.经密度梯度离心分离，体外培养纯化的猕猴BMSCs细胞均一性高，以梭形细胞为主，传代、增殖能力强，具有多向分化潜能。表达BMSCs的表面标志，而不表达造血干细胞的表面标志。不表达MHC Ⅱ类分子和B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、等共刺激分子。这一特点使同种异体BMSCs移植可逃避免疫排斥反应。　　 2.化学萃取法制备的猕猴长段去细胞神经支架，因去除了细胞、轴突及髓鞘结构而免疫原性极低，同时又保留了对神经再生有重要作用的天然神经的支架结构和细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)。　　 3.自体BMSCs植入去细胞同种异体神经支架修复猕猴40mm尺神经缺损的效果与自体神经移植效果无显著性差异。　　 4.体外培养的BMSCs具有分泌NGF和GDNF的能力，随培养时间延长虽细胞数量增加，但其分泌NGF和GDNF的能力有所下降。5.同种异体BMSCs植入去细胞神经支架修复猕猴外周神经缺损初步实验结果显示，同种异体BMSCs能在体内存活、增殖和迁移，未引起明显的免疫排斥反应，并具有促神经再生功能。