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背景肝脏是机体代谢的最主要场所,也是机体最容易遭受到损伤的脏器之一,肝损伤已成为威胁人类健康的重要疾病之一。线粒体是细胞“发动机”,在肝细胞能量代谢、自由基产生、细胞凋亡及脂质代谢等生命活动中起着重要作用。研究表明,肝细胞线粒体结构或功能受损将导致肝脏损伤,而很多中药能通过调节线粒体而发挥肝脏保护作用,但其药效物质仍不清楚。因此,以线粒体为靶点筛选中药保肝成分是揭示中药保肝药效物质基础及发现先导化合物的重要途径。而当前以线粒体为靶点筛选中药保肝成分的方法存在局限,需制备得到单体化合物后再进行药理实验确定。急需寻找一种不经分离纯化,直接从中药复杂体系中快速、有效筛选中药保肝成分的分析方法。目的建立一种以肝细胞线粒体为靶点的中药保肝成分快速、有效筛选方法,使用该方法筛选中药保肝成分,发现保肝先导化合物,并为揭示中药调节线粒体而发挥保肝作用的药效物质提供有力依据。方法取SPF级雄性SD大鼠新鲜肝脏,匀浆后用差速离心法制得线粒体,分别采用透射电镜、线粒体分离纯度双酶法（SDH/AP）测定试剂盒及荧光分光光度法评价线粒体的结构完整性、纯度及生物学功能;联合亲和超滤和LC/MS,构建以肝细胞线粒体为靶点的集“识别-分离-鉴定”于一体的保肝成分筛选方法,并利用阳性对照药（水飞蓟宾、大豆苷）、阴性对照药（阿莫西林、葡醛内酯）以及它们所组成的混合对照品溶液验证筛选方法可行性;采用待筛选中药提取物（前胡、羌活）考察重要筛选条件（线粒体浓度、被筛选样品浓度、孵育时间）对筛选结果的影响;应用所建方法筛选2种中药（前胡、羌活）提取液中作用于线粒体的活性成分,并用LC/MS及对照品指认活性化合物结构;分别采用紫外分光光度法、荧光分光光度法和ATP酶测定试剂盒考察化合物对离体肝细胞线粒体的膜通透性转换孔（mPTP）开放度、膜电位（?Ψm）和ATP酶活性的影响,验证被筛选化合物与线粒体的直接作用;通过考察化合物对CCl4诱导的肝L02细胞急性肝损伤模型的细胞存活率、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的影响,验证化合物的体外保肝活性;通过考察化合物对CCl4损伤的小鼠肝指数、肝组织形态学,血清ALT、AST含量,肝脏MDA、谷胱甘肽（GSH）和SOD的影响,以及对线粒体相关指数(m PTP开放度、?Ψm、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、MDA)的影响,进一步验证化合物的体内保肝活性。结果肝细胞线粒体完整性、纯度和生物学功能评价:电镜下观察结果表明所制备线粒体膜连续、脊明显,结构完整;SDH/AP试剂盒分析结果显示,琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）的活性是酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）活性的21倍,表明线粒体纯度较高;荧光检测结果发现线粒体经羰酰氰氯苯腙（CCCP）处理后,荧光强度显著升高,膜电位崩溃,表明线粒体仍维持原生物学功能。建立筛选方法并评价其可行性:以肝细胞线粒体为靶点的筛选方法可选择性地识别出混合物中结合于线粒体的活性物质（阳性对照药）,且利用超滤技术可将识别到的活性成分分离出来,同时直接排除不与线粒体结合的非活性成分（阴性对照药）,最后采用LC/MS可方便鉴定出活性物质的结构,所建筛选方法可行。筛选方法的重要影响因素研究:3种筛选条件均会显著影响筛选结果（筛选到的活性成分数量和种类）。本文以肝细胞线粒体浓度为0.50-1.00 g/L,样品浓度为12.38 g/L,孵育时间为90 min为最佳筛选条件。但在筛选不同样品时,需分别优化这些影响因素,以获取最佳筛选结果。中药保肝成分筛选研究:从2种中药中共筛选到19种可与线粒体结合的活性化合物,采用LC/MS和对照品指认了14种,且14种为本研究首次发现的可与线粒体结合的活性物质。采用离体肝细胞线粒体验证筛选结果发现7种筛选到的活性化合物可显著抑制肝脏mPTP开放,降低线粒体膜电位及提高ATP酶活性,发挥线粒体保护作用。体外、体内实验验证化合物保肝作用:5种被筛选化合物（白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡丁素、白花前胡素E、异欧前胡素）均能显著升高细胞存活率和SOD的含量,显著降低ALT、AST、MDA的含量,进而发挥肝细胞保护作用。2种化合物（白花前胡乙素、异欧前胡素）均能显著降低肝指数,改善肝组织形态学病变,降低血清ALT和AST含量,显著降低肝脏MDA的含量,显著升高肝脏中SOD、GSH含量,并有效改善线粒体损伤程度(降低mPTP开放度,回升线粒体膜电位,增加线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,降低MDA含量)从而有效改善小鼠肝损伤程度。结论本研究建立了一种以肝细胞线粒体为靶点的集“识别-分离-鉴定”于一体的筛选方法,为中药复杂体系中的保肝成分快速、有效筛选提供新途径。从前胡、羌活2种中药材提取物中共筛选到19种活性化合物,证实其中7种被筛选活性化合物可直接作用于线粒体而影响离体线粒体mPTP开放度、ΔΨm和ATP酶活性,这些成分可能是被筛选中药直接作用于肝线粒体的主要物质基础。利用体内和体外药理实验证实了5种被筛选化合物的保肝作用,结果将有助于揭示被筛选中药调节线粒体而发挥保肝作用的药效物质。