三叶木通总黄酮和多糖的提取纯化及生物活性研究

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三叶木通(Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.)为木通科(Lardizabalaceae)木通属落叶木质藤本植物,分布在长江流域,陕西南部(汉中、商洛地区居多)、山西晋南地区、甘肃东南部以及重庆地区。在湖北、湖南、四川、山东、江苏、河北、江西、浙江、河南等地也有分布。其干燥藤茎可作为中药“木通”入药,干燥近成熟果实可作为中药预知子入药。研究证明,三叶木通中的主要有效成分是三萜皂苷类物质,此外,在其果实、根、种子、叶片中还含有一些黄酮类、油脂、氨基酸、多糖、酚类、甾类、木质素类等多种化学成分。三叶木通的黄酮类和多糖类化合物具有抗氧化,提高人体抗病能力,延缓衰老,抗炎防癌等多种生物活性。本论文采用超声辅助提取法和微波辅助提取法优化三叶木通总黄酮的提取条件;测定了根、藤茎、叶、果皮、果肉、种子、7-26年生藤茎和7个省18个产地的三叶木通总黄酮含量;采用大孔吸附树脂分离纯化了三叶木通总黄酮,并比较了其纯化物和粗提物的抗氧化功效;利用HPLC测定了三叶木通多糖的单糖组成;研究了多糖的抗氧化和排铅作用。论文的主要结果如下:1.通过测定得出三叶木通根中总黄酮含量最高,为5.72%;果肉中总黄酮含量最低,仅为0.2%;果肉与种子中总黄酮含量无显著性差异;叶和8-10年生茎总黄酮含量无显著性差异;果肉、叶、果皮、根、1-2年生茎、8-20年生茎和25-27年生茎有显著性差异。16年生的三叶木通藤茎总黄酮含量最高为9.34%,9年生的三叶木通藤茎总黄酮含量最低为3.17%。8年生和14年生三叶木通总黄酮含量无显著差异。12年生和10年生无显著差异。18年生和19年生无显著差异。最佳总黄酮利用部分为根。最佳总黄酮利用采收期为16年生。2.通过测定七省份不同产地三叶木通总黄酮含量,发现总黄酮含量在不同的产地间有显著性差异。其含量大小顺序依次为湖南>湖北>贵州>陕西>河南>甘肃>山西。十六个产地三叶木通总黄酮含量大小顺序依次为湖南张家界慈利县>湖北鹤峰县太平四平村>湖南石门县>湖南桑植利县九天洞村>湖北神农架区松柏>贵州镇远>湖北神农架林区木鱼镇>湖南桑植县洪家关>陕西镇安银坪村西沟>陕西镇安回龙镇渣家沟>陕西镇安三叶木通基地>河南西峡五里桥天顶村>陕西镇安回龙镇肖家沟>河南西峡丁河镇瓦房村>甘肃两当鱼池乡后沟>山西垣曲天盘山。对实验的进行了方法学考察,所得的精密度、稳定性和加样回收率的RSD值均小于3.0%,实验系统稳定,方法可靠。3.通过超声辅助法和微波辅助法提取三叶木通总黄酮工艺的研究得出以下结果:(1)超声辅助提取法中各影响因素影响的大小顺序为:提取次数>料液比>提取时间>乙醇浓度,即提取次数对三叶木通提取率影响最大,料液比次之,乙醇浓度影响最小,最优条件为:提取次数3次,料液比1:30(g:mL),提取时间30min。SPSS17.0统计软件方差分析表明提取次数对三叶木通提取率有显著影响。(2)微波辅助提取法中各影响因素的顺序为:微波功率>乙醇浓度>料液比>提取时间,即微波功率对三叶木通提取率影响最大,乙醇浓度次之,最优条件为:提取次数3次,料液比1:30(g:mL),提取时间30min。SPSS17.0统计软件方差分析表明提取次数对三叶木通提取率有显著影响。4.通过对AB-8、 D101、HPD722、HPD826、HPD450和HPD600大孔吸附树脂的帅选,最终选择HPD722为纯化三叶木通总黄酮的树脂。将预处理好的HPD722树脂装入(40×1.6cm)的柱中,体积为柱的2/3,用100m1蒸馏水按1ml/min的速度洗树脂,然后加入准备好的样液225m1进行吸附,流速为1ml/min,最后用100ml的60%的乙醇洗脱黄酮。得总黄酮得率为48%。5.通过DPPH自由基体系、羟基自由基(·OH)体系和还原能力体系比较了三叶木通粗黄酮和纯化后黄酮的抗氧化能力。结果显示三叶木通粗黄酮和纯化后黄酮均有一定的抗氧化活性,其中纯化后黄酮抗氧化性高于粗黄酮。其抗氧化能力仅次于BHT。6.经HPLC测定三叶木通多糖的单糖组成为:D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖。7.通过DPPH自由基体系、羟基自由基(.OH)体系和还原能力体系测定了三叶木通多糖的抗氧化活性。结果显示三叶木通多糖具有很好的抗氧化活性,当达到一定浓度时其抗氧化能力仅次于VC。本研究为开发无毒无害的抗氧化剂提供理论基础。8.三叶木通多糖对小鼠的排铅试验中结果显示三叶木通多糖具有一定的排铅作用。
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