铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是医院感染的最常见病原菌之一。作为条件致病菌，它主要感染免疫功能低下的病人，可以引起烧伤后感染、手术后伤口感染及肺部感染等。铜绿假单胞菌对环境适应能力极强，能在多种环境中存活，尤其在潮湿环境中可以长期生存，常常引起严重的环境污染及器械设备污染。铜绿假单胞菌具有极强的耐药性，能够抵抗多种抗生素，一旦感染很难被清除。因此，铜绿假单胞菌感染的防御及治疗受到越来越广泛的关注。　　近年来的研究表明，铜绿假单胞菌的耐药性主要与其生物被膜(生物膜，Biofilm)的形成有关。生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌胞外基质(Extracellular matrix)并将其自身包绕其中而形成的大量细菌膜状聚集物。自然界中的大部分细菌主要以生物被膜的形态存在。与游离细胞相比，生物被膜中的细菌具有极强的耐药性，能够更好地耐受抗生素和宿主的免疫反应，并且在细胞形态和生理上会发生很大的变化。胞外基质是生物被膜的主要组成部分，占到生物被膜总体积的85％，为生物被膜的形成提供支架，并且可以促进生物被膜细胞之间的交流。胞外基质主要包括胞外多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)、蛋白质、核酸、脂类及细胞残骸等。其中，胞外多糖又是胞外基质的主要成分。铜绿假单胞菌由于分布广泛、极易形成生物被膜，成为生物被膜研究的模式菌株。　　鞭毛作为细菌重要的毒力因子，除了与运动性相关之外，还在生物被膜形成初期及微菌落形成过程中起到了重要的吸附作用。铜绿假单胞菌在菌体的一端生有单根鞭毛，但是其合成和调控却需要四十多种基因参与。这些基因根据表达及调控顺序的不同共分为四级。其中，FleQ作为主导调节因子，调控其它基因的转录。之前的研究发现，FleQ作为一种新型的c-di-GMP受体，还参与EPS基因的转录调控。序列比对结果显示FleQ属于NtrC双组分磷酸化家族，但是缺少该家族中保守的磷酸化位点及相应的磷酸化激酶。除此之外，序列分析发现FleQ不含有保守的c-di-GMP结合结构域。因此，FleQ与c-di-GMP的结合方式以及它调控基因转录的作用机制受到越来越多的关注。　　本文的第一部分主要对P.aeruginosa PAO1中转录调节蛋白FleQ REC结构域(FleQR)的结构和功能进行了研究。我们对FleQR进行了纯化和结晶，并解析了其晶体结构。通过与磷酸化蛋白NtrC和StyR的REC结构域进行结构比对，我们发现FleQR与这些蛋白在结构上存在明显差异。由于FleQR的这种特殊性，我们首先验证它对于FleQ发挥功能是否是必须的。我们构建了fleQ的基因敲除与回补菌株，并对这些菌株进行了体内功能实验及体外生化实验。实验结果显示，REC结构域缺失后，鞭毛基因不能转录，菌体丧失了移动性，并且EPS基因转录水平明显上升。这表明REC结构域对于FleQ发挥功能是必不可少的。我们进一步通过结构分析和生化实验发现，FleQR在溶液中以一种“transverse dimer”的形式存在，并且氨基酸F26在二体形成中起到了关键的作用。这种二体形式在其它同源蛋白中尚未被报道过。我们的实验结果显示，该二体形式对FleQ发挥功能是十分重要的，破坏或减弱二体形成会对FleQ的功能产生不同程度的影响。除此之外，我们通过同源建模分析找到了FleQ结合c-di-GMP的关键氨基酸R144和R185，并且通过功能实验和ITC实验进行了验证。我们的实验结果还显示，ATP和c-di-GMP由于结合位点在空间位置上接近，二者的结合会相互影响，并且二体状态对于FleQ结合c-di-GMP也是必需的。最后，在所有实验结果的基础上，我们提出了一个FleQ调控鞭毛基因转录的简单模型。　　本文的第二部分主要对P.aeruginosa PAO1中糖苷水解酶PslG的结构和功能进行了研究。前面提到，胞外多糖对细菌生物被膜的形成十分重要。铜绿假单胞菌主要产生三种胞外多糖:alginate、Pel和Psl。Psl是PAO1胞外基质的主要成分，对生物被膜的形成及抗生素抗性起到了关键性的作用。Psl由五糖重复单元组成，包括D-甘露糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖。Psl可以在生物被膜细胞表面形成螺旋的网状物，将细胞包裹其中，进而在生物被膜形成过程中促进细胞与细胞之间以及细胞与表面之间的交流。　　P.aeruginosa中Psl的合成和分泌依赖于12种psl基因(PA2231-PA2242)。PslG(PA2237)位于周质空间，对Psl合成是必需的。将pslG基因敲除后菌株不能合成Psl，并且生物膜的形成量大大降低，但其具体功能尚不清楚。有趣的是，通过NCBI数据库进行序列BLAST以及之前所报道的结构预测都显示PslG属于CAZy糖苷水解酶第39家族。　　通过与中国科学院微生物所马旅雁研究员课题组合作研究发现，在细菌体内过表达PslG以及向培养基中外源添加PslG蛋白，均可以抑制PAO1生物被膜的形成，并且可以水解已经成熟的生物被膜。免疫印迹及多糖水解分析实验显示，PslG可以直接降解Psl。为了研究其分子机制，我们解析了PslG的晶体结构，确定了催化结构域、多糖结合结构域(CBM)以及关键的催化氨基酸(Glu165，Glu276)，并对参与活性中心构成的其它氨基酸进行了分析。结构分析显示PslG具有典型的糖苷内切酶的特征。我们通过Molecular Docking构建了PslG与Psl四糖的作用模型，并通过结构分析推测PslG催化水解β-D-Man和α-L-Rha之间的1-3糖苷键。除此之外，分子筛层析实验显示，PslG在superdex200上的出峰位置明显滞后，间接地证明了CBM结构域可能参与多糖结合。　　综合来讲，本文主要研究了两种铜绿假单胞菌生物被膜相关蛋白FleQ和PslG的结构及功能，初步阐释了它们的作用机制。FleQ调控鞭毛和生物被膜的合成;PslG可以抑制并水解生物被膜。鉴于鞭毛和生物被膜在铜绿假单胞菌致病性中的重要作用，我们的研究将对这类细菌感染的治疗提供非常有力的帮助。