研究背景和目的结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是人类常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势。多数结直肠癌患者在行根治性手术前已出现微转移,而转移是导致患者死亡的主要因素。如何提高结直肠癌转移预测、诊断和早期干预水平对降低结直肠癌死亡率至关重要；因此,阐明结直肠癌转移相关机制,筛选、鉴定转移相关分子是当前结直肠癌研究的重要内容。正常情况下,细胞生长、增殖、分化及死亡是一个有序过程。肿瘤的形成是这一过程出现紊乱所致,其发生发展是一个复杂的过程,涉及多个基因在时间及空间上的功能异常或表达失调。近年来研究发现,除了蛋白编码基因能够调节肿瘤侵袭转移外,也存在一些非编码基因参与肿瘤的侵袭转移过程。非编码基因主要包括小非编码基因(如micro RNA分子等)及长链非编码基因(long/large non-coding RNA)。长链非编码基因通常指长度大于200nt且不具有蛋白翻译功能的转录本；目前研究表明,长链非编码RNA的紊乱与多种疾病相关,其发挥作用可通过表观遗传、转录水平及转录后水平上进行相关调控。本课题组前期对来自同一亲本、不同转移潜能结直肠癌细胞株(SW480、M5)进行lncRNAs芯片分析之后,发现一些差异表达lncRNA基因簇；其中FEZF1-AS1在高转移潜能M5细胞株中表达明显高于低转移细胞株SW480,这提示其表达失调可能与结直肠癌发生及转移相关,但其具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨FEZF1-AS1在结直肠癌增殖、侵袭及转移中的作用及可能机制。方法1、采用Arraystar LncRNA芯片分析不同转移潜能结直肠癌细胞株间lncRNA差异表达谱,通过Real-time PCR检测结直肠癌细胞株及小样本配对结直肠癌组织中差异表达lncRNAs的表达情况,筛选确定结直肠癌转移相关长链非编码RNA FEZF1-AS1;应用Real-time PCR检测不同结直肠癌细胞株及大样本配对结直肠癌组织中的表达；采用原位杂交方法检测FEZF1-AS1在具有随访资料临床结直肠癌石蜡组织中的表达,通过SPSS13.0软件分析其表达水平与临床病理因素之间的联系及预后意义。2、采用慢病毒感染方法构建稳定干扰FEZF1-AS1的细胞株(HCT116-Ai,Ci/M5-Ai,Ci)和对照细胞株(HCT116-NC/M5-NC)。3、采用CCK8、平板克隆实验检测细胞增殖能力并分析细胞周期；迁移实验、划痕实验、侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力；裸鼠皮下成瘤实验、肿瘤细胞裸鼠尾静脉注射肺转移实验观察结直肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力及转移能力。4、采用免疫组化方法检测大样本临床结直肠癌石蜡组织中FEZF1蛋白的表达,用Real-time PCR方法检测FEZF1在配对结直肠癌组织(标本同检测FEZF1-AS1一致)及相关结直肠癌细胞株中的表达情况,同时采用western blot检测FEZF1在相关结直肠癌细胞株中的表达,通过SPSS13.0软件分析初步探讨FEZF1在结直肠癌中的作用,并分析其与FEZF1-AS1的相关性,应用生物信息学分析初步建立FEZF1-AS1与其反应链的关系。结果1、不同转移潜能结直肠癌细胞株中lncRNA差异表达谱的建立前期工作中采用Arraystar Human LncRNA Microarry芯片,结合生物信息学分析筛选出在不同转移潜能结直肠癌细胞株(SW480/M5)之间存在的差异表达lncRNA谱。2、结直肠癌转移相关lncRNA的筛选Real-time PCR方法在SW480及M5细胞株中分别检测以上筛选到的lncRNAs的表达情况,结果表明FEZF1-AS1等lncRNAs在高转移结直肠癌细胞株M5中表达明显高于SW480,并从中挑选出在两株细胞株中表达水平明显差异的FEZF1-AS1作为转移相关靶分子,进一步在M5、HCT116、lovo、SW620及Caco、DLD1、HT29、SW480细胞中检测FEZF1-AS1的表达,结果显示在高转移潜能细胞株中(M5、HCT116、lovo、SW620)其表达明显高于低转移潜能细胞株(Caco-2、DLD1、HT29、SW480);同时,在小样本结直肠癌临床配对样本中检测发现,在癌组织中其表达高于相应配对癌旁正常组织,且在伴有转移的结直肠癌组织中其表达高于不伴有转移癌组织(P<0.05)。因此靶定FEZF1-AS1作为后续研究的重点。3、FEZF1-AS1在结直肠癌组织中的表达及临床病理因素及预后相关性分析Real-time PCR结果显示,在34配对结直肠癌临床标本中,癌组织中FEZF1-AS1的表达明显高于相应配对的癌旁正常组织(P=0.002)。原位杂交结果显示,FEZF1-AS1在153例结直肠癌石蜡组织中阳性表达率58.17%(89/153)。统计分析显示,在本组结直肠癌患者中,FEZF1-AS1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置均无显著相关性(P>0.05),而FEZF1-AS1的表达与淋巴结转移(P<0.001)、远处转移(P<0.001)、Dukes分期(P<0.001)、分化程度(P=0.032)显著相关。采用Kaplan-Meier法分析5年生存曲线,发现高表达FEZF1-AS1的结直肠癌患者中位生存时间为53.525月,低表达FEZF1-AS1的结直肠癌患者中位生存时间为79.404月；通过Log-Rank检验比较两组生存曲线差异,结果表明FEZF1-AS1低表达组患者总体生存率高于FEZF1-AS1低表达组,差异显著(P=0.002)；多因素Cox比例风险模型预后分析显示,FEZF1-AS1是影响预后的危险因素(P=0.035)；FEZF1-AS1的HR=2.401,表明FEZF1-AS1高表达的患者预后较低表达患者预后差(P=0.035)。4、干扰FEZF1-AS1的表达降低HCT116/M5细胞的增殖及侵袭迁移能力采用慢病毒感染方法将带有靶向敲低FEZF1-AS1表达干扰片段及无关序列病毒上清分别转染HCT116及M5细胞,经流式细胞仪分选并经Real-Time PCR鉴定,得到稳定干扰FEZF1-AS1的细胞株(HCT116-Ai/Ci,M5-Ai/Ci)及对照细胞株(HCT116-NC,M5-NC)。CCK8(FHCT116=91.25, P<0.001; FM5=183.833, P<0.001)、平板克隆形成实验(F HCT116=34.609,P=0.001;FM5=8.875,P=0.016)显示,与对照组相比,HCT116-Ai/Ci,M5-Ai/Ci细胞的体外增殖能力明显降低。迁移实验(FHCT116=91.477, P<0.001;FM5=174.358, P<0.001)、侵袭实验(FHCT116=95.128, P<0.001;FM5=238.472, P<0.001)和划痕实验表明,HCT116-Ai/Ci,M5-Ai/Ci细胞的体外侵袭迁移能力明显降低。裸鼠皮下成瘤实验(F=37.381,P<0.001)表明敲低FEZF1-AS1的表达降低HCT116、M5细胞的体内成瘤能力。鼠尾静脉注射实验(P=0.036)结果表明,干扰FEZF1-AS1的表达可降低HCT116细胞在裸鼠体内的肺转移能力。5、FEZF1-AS1的正义链FEZF1的表达情况Real-time PCR结果显示,在30对配对结直肠癌组织中,FEZF1-AS1的正义链FEZF1的表达高于其配对正常组织(P=0.049)；免疫组化结果显示,在153例具随访资料结直肠癌患者石蜡组织(随访时间为2-96个月,中位随访时间为67.56个月)中阳性表达率达92.1%(141/153)。采用Kaplan-Meier法分析5年生存曲线,发现FEZF1高表达的结直肠癌患者生存率仅为56%,而低表达FEZF1的患者5年生存率达73%；进而Log-Rank检验比较两组生存曲线的差异,表明FEZF1低表达组的总体生存率优于高表达组,差异具有统计学意义(P=0.031)。6. FEZF1-AS1与其正义链FEZF1的相关性Western blot方法检测FEZF1在以上所构建的干扰稳定细胞株中的表达情况,发现与对照组细胞相比,稳定干扰FEZF1-AS1的细胞中,FEZF1的表达明显降低,其表达变化趋势与FEZF1-AS1一致。同时通过分析20对临床样本Real-time PCR结果,发现FEZF1-AS1与FEZF1的表达存在显著相关性(r=0.741,P<0.001)。使用RNAfold分别对mRNA和lncRNA进行二级结构预测发现,两者结合的的最小自由能(Co-RNA:-2703.54)远远小于两者单独形成二级结构的自由能(FEZF1-AS1:-1037.42; FEZF1:-755.31),可以说明二者容易结合,并具有较高的稳定性。结论1、FEZF1-AS1在结直肠癌中高表达,且与淋巴结转移、远处转移、Dukes分期、分化程度等呈正相关,FEZF1-AS1是影响结直肠癌预后的危险因素；2、FEZF1-AS1在结直肠癌的增殖、侵袭、迁移过程中起着重要的作用；3、FEZF1-AS1可能与其正义链FEZF1通过结构上的相互作用从而发挥其在结直肠癌增殖、侵袭、迁移中的作用；4、FEZF1-AS1有可能作为结直肠癌患者进展及预后的新分子标记物,从而为结直肠癌的预后及治疗提供新的分子靶点。本研究的创新之处(1) FEZF1-AS1是我们利用lncRNA芯片从具有不同转移潜能的结直肠癌细胞株中筛选的与结直肠癌转移密切相关的lncRNA,其功能及作用机制尚未见报道；我们通过体内、体外相关功能实验,明确其在结直肠癌中的作用,具有原始创新性。(2)通过验证FEZF1-AS1与其正义链之间的相关性,利用生物信息学分析预测两者单独形成二级结构、共同形成二级结构的可能,初步提示两者可能通过共同形成稳定二级结构而发挥生物学功能。(3)本研究从lncRNA这个新的视野为阐明结直肠癌侵袭转移的相关机制提供新依据与新思路。