生物体内无时无刻的进行着代谢活动,发生着氧化还原反应,氧化还原反应参与了机体的正常生理和多种疾病的的发病机制,而活性氧的生理指标可以反映出生物体的生理或病理状态。通常情况下我们认为活性氧对于机体的生存是有害的,活性氧产生过多会导致癌症的发生以及机体一些慢性疾病的产生,并且会激活不同的细胞代谢死亡通路,但是,目前越来越多的研究证明,低浓度的活性氧水平对于机体来说是有益的,尤其是在一些依赖氧化还原反应信号分子的信号通路中,活性氧扮演者重要的角色。活性氧是一把双刃剑,所以严格维持机体内的氧化还原稳态,对细胞的增殖、生长、发育、代谢以及保护细胞免受氧化应激等过程都十分重要。因此,实时监测机体细胞内活性氧的变化,对监测细胞的正常生命活动以及一些潜在疾病具有重要的指导意义。本研究中,我们利用iLOV蛋白结构域与FMN非共价结合形成发色团,通过电子得失改变iLOV蛋白的结构,从而使该蛋白荧光发生变化,以此来显示细胞内氧化还原水平的变化,从而达到监测细胞内的活性氧的变化的目的。为此,通过Py MOL软件分析iLOV蛋白的结构域,突变氨基酸残基,来改变电子传递及蛋白质的空间结构,预测出了5种iLOV突变体。构建原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导iLOV蛋白及其突变体的表达;加入还原剂DTT和氧化剂H2O2,在激光共聚焦显微镜下观察大肠杆菌荧光的变化;比较荧光强度变化幅度,筛选出iLOV有3种突变体较原始iLOV 1.0荧光强,其中突变体iLOV 3.0荧光的变化范围最广,且对还原剂和氧化剂的响应更加敏感。因此,初步认为突变体iLOV 3.0适合作为检测活性氧探针的供体蛋白;表达纯化iLOV 1.0蛋白和突变体iLOV 3.0蛋白,测定其荧光光谱的理化性质,观察发现iLOV 3.0突变体荧光蛋白的变化存在可逆性,且变化幅度大于iLOV 1.0,这进一步确定突变体iLOV 3.0适合作为感应活性氧变化的荧光探针,并命名为pH-ROS探针。我们将筛选出来的pH-ROS探针在多种哺乳动物细胞系中进行表达,结果显示:在HEK293T细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、He PG2细胞、K562细胞（半悬浮细胞）、EC9706细胞、PK-15等细胞中都能正常表达,表明探针具有普遍适用性;其次,在探针上加细胞器定位序列,可以成功将探针定位在不同的细胞器上,证明探针具有一定的时空特异性;为了检验探针的能否精确的感知外源性活性氧的变化,我们瞬时转染了探针,并在HEK293T细胞培养基中加入不同浓度的H2O2和NAC,发现探针的荧光正如我们预期那样,随着H2O2和NAC的浓度变化而变化。同时,我们还选择了一个固定浓度的H2O2条件,观察到细胞的荧光可随时间推移发生持续的变化;为了验证探针能否感应内源性活性氧的变化,通过改变细胞的营养代谢以及敲除和过表达活性氧相关酶类,研究发现pH-ROS探针的荧光变化符合预期,即在糖环境胁迫条件下,荧光变强,敲除活性氧相关酶类后探针荧光变强,过表达活性氧相关酶类后荧光变弱。最后,我们在猪PK-15细胞中进行猪伪狂犬病毒（PRV）侵染实验,研究发现,在病毒感染过程中,荧光逐步增强,说明活性氧水平是逐步上升的;利用LC-MS代谢组学分析发现,PRV感染PK-15细胞后,加强了有氧代谢的三羧酸循环、戊糖磷酸途径,降低了无氧代谢的糖酵解。综上,我们筛选出的突变体iLOV 3.0的探针在哺乳动物细胞中应用效果比较理想,能准确响应细胞内活性氧的变化。此活性氧荧光探针对生物药物筛选、疾病监测和动物疾病模型的构建等方面具有巨大应用前景。