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大豆(Glycinemax[L.]Merrill)是世界上重要的经济和粮食作物之一,也是我国的战略性物资。高温高湿、重金属等非生物胁迫是制约大豆生产,影响种子发育和品质的重要因素。我国南方春大豆在种子生理成熟期(R6期-R7期),常处于高温、多雨的季节,极易发生田间劣变,导致种子活力下降,严重制约了春大豆的生产。另外,重金属污染也是当前不容忽视的污染问题之一,重金属污染不仅对作物生长发育造成严重影响,而且能够通过食物链危害人体健康。前期研究发现GmSBH1参与了高温高湿胁迫响应以及种子活力形成,并以GmSBH1为诱饵蛋白,对春大豆高温高湿酵母双杂交cDNA文库进行筛选,初步得到可能与之互作的大豆重金属相关域包含蛋白GmHMADP和未知功能蛋白GmHP61。为探究GmHMADP和GmHP61基因在响应非生物胁迫中的功能,本研究拟选用GmHMADP和GmHP61两个基因作为研究对象,以种子田间劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号为材料,在此基础上开展以下研究:(1)大豆GmHMADP和GmHP61基因的分离,及其编码的蛋白分别与GmSBH1互作的验证;(2)GmHMADP和GmHP61基因在抗劣变品种湘豆3号和不抗劣变品种宁镇1号不同组织器官、种子发育过程中以及高温高湿胁迫(40℃/100%RH)下的表达特性分析;(3)GmHMADP和GmHP61基因参与高温高湿胁迫下种子活力形成的功能验证;(4)GmHMADP基因在重金属铜、镉胁迫下的表达特性分析及其参与铜、镉胁迫的功能验证。主要研究结果如下:1、分离得到大豆GmHMADP基因,其ORF全长996bp,由4个外显子与3个内含子组成。通过对与GmHMADP同源性高的蛋白的氨基酸序列进行多重比对,发现均含有HMA结构域,并且具有2个金属离子结合位点特征序列CXXC。分离得到大豆GmHP61基因,其ORF全长468bp。基因枪介导烟草叶肉细胞GFP瞬时表达实验表明,GmHMADP与GmHP61基因编码的蛋白均定位于细胞核和细胞膜上。酵母双杂交以及双分子荧光互补(BIFC)实验结果表明,GmSBH1能够分别与GmHMADP以及GmHP61发生互作。2、qRT-PCR结果表明,GmHMADP基因分别在宁镇1号和湘豆3号2个品种的成熟和发育中的种子中表达量最高。种子发育过程中,GmHMADP基因总体呈先上升后下降的表达趋势,且在花后40天表达量达到最高。在宁镇1号种子中,高温高湿胁迫48、96和168 h后,GmHMADP的表达量显著(p<0.01)升高;在湘豆3号中,该基因在处理24、48、96和168 h时表达量显著(p<0.01)升高。此外,湘豆3号中,GmHMADP的表达量在不同浓度Cu2+、Cd2+的诱导下均显著(p<0.01)升高;而宁镇1号中,GmHMADP的表达量仅在50 μmol·L-1 Cu2+和200 μmol·L-1 Cd2+处理下显著(p<0.01)升高。GmHP61基因分别在宁镇1号和湘豆3号成熟和发育中的种子中表达量最高。种子发育过程中,在宁镇1号中花后第40天表达量达到最高,在湘豆3号中花后第30天表达量达到最高。大豆植株在种子生理成熟期经高温高湿胁迫处理后,在宁镇1号种子中,GmHP61基因在胁迫处理48和168 h时表达量显著(p<0.01)上升,而在湘豆3号种子中,该基因在处理24、96和168 h时表达量显著(p<0.01)上升。以上结果表明GmHMADP和GmHP61基因在转录水平上响应高温高湿胁迫,且GmHMADP基因在转录水平上响应铜镉胁迫。3、通过农杆菌侵染法分别获得GmHMADP和GmHP61过表达拟南芥株系。拟南芥植株荚黄熟期时进行高温高湿处理发现,GmHMADP和GmHP61过表达株系种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均优于WT。表明过表达GmHMADP和GmHP61均可提高拟南芥种子活力。此外,经Cu、Cd胁迫后,GmHMADP转基因拟南芥株系的根长和干重均显著(p<0.05)高于野生型植株。表明GmHMADP在拟南芥中过表达能够提高植株对Cu、Cd胁迫的抗性。通过以上研究,为进一步深入研究GmHMADP和GmHP61基因在参与大豆生长发育和响应逆境胁迫等方面的生物学功能奠定分子基础。