论文部分内容阅读
目的：直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，低位直肠癌所占的比例高，占直肠癌的75%。近年来，虽经规范手术及术后化疗、放疗等其他综合治疗有一定的效果，但仍有40%-50%患者在五年内死于复发和远处转移，推测可能与患者手术时已存在微转移有关。患者是否存在微转移是决定其手术范围及术后生存质量的重要因素之一。因此，如何才能早期检测到微转移，是临床研究的重点之一。随着大肠癌癌基因，肿瘤相关抗原及分子生物学技术研究的深入，大肠癌的淋巴结、血液、骨髓及各脏器的常规组织学难以诊断的癌细胞微转移灶的检测已经变成可能，应用RT-PCR技术扩增肿瘤患者外周组织（血管、淋巴结等）肿瘤细胞标志性靶mRNA来证实肿瘤细胞的存在是分子水平检测肿瘤微转移的实验基础。由于癌细胞大多保留起源细胞CK类型，故可通过测定CK类型来判断癌细胞起源。大量研究表明，CK20尤其在直肠癌中有着较强的组织特异性。以前曾在下段直肠癌患者腹腔中发现有种植转移，为探讨腹腔内有无早期种植转移及其机理，本课题采用RT-PCR方法，通过对上皮源性肿瘤标志性基因CK20 mRNA的检测，准确判断低位直肠癌患者腹腔灌洗液以及淋巴结中是否存在低位直肠癌微转移，该研究对比常规病理检测，力图探讨低位直肠癌对肿瘤分期，规范治疗以及预后的影响。 <WP=4>方法：随机选取2002年6月至2002年11月在河北医科大学第四医院行外科根治性手术治疗的35例低位直肠癌（腹膜返折以下）患者的区域淋巴结和腹腔灌洗液标本。区域淋巴结标本均于离体半小时内采集，液氮速冻，后放置于-80℃冰箱储存备用；所有标本均经术后病理证实。腹腔灌洗液于手术开始后马上留取200ml，其中100ml做腹腔灌洗液细胞学（peritoneal lavage cytology, PLC）检查，另外100ml经离心后马上用Trizol法提取总RNA，经凝胶电泳检测无降解后进行反转录，转录出的cDNA以β-actin作为内参照标准，通过针对CK20的特异性引物进行扩增，对扩增产物通过凝胶成像系统进行扫描分析，从而判断是否存在肿瘤细胞。根据基因CK20的阳性率的检出情况，运用χ2检验对数据进行统计学分析。结果：1 35例低位直肠癌患者的腹腔灌洗液中，以常规细胞学方法检测，有6例阳性，占17.1%,其中A期0例，B期1例(16.7%),C期4例(66.7%),D期1例(16.7%)，阳性率逐渐增加。 以RT-PCR方法检测，腹腔灌洗液中CK20mRNA阳性25例 ，占71.4%，,其中A期1例（4%），B期3例(12%),C期16例(64%),D期5例(20%)，DukesA,B,C期阳性率逐渐增加。RT-PCR法检测阳性率明显优于细胞学检测，χ2=20.902，p＜0.05。DukesA、B期与DukesC、D期相比，有显著性差异，χ2=4.323，p＜0.05。2 35例低位直肠癌患者中，9例肿瘤周径＜1/2的标本，用RT-PCR方法检测腹腔灌洗液中CK20mRNA，其中6例阳性，阳性率为66.7%，而在肿瘤周径≥1/2的26例标本中，21例为阳性，阳性率为80.8%，经统计学分析，χ2=0.754，p＞0.05，<WP=5>另外，在10例未侵出肌层的标本中，RT-PCR检出有4例腹腔灌洗液中CK20表达阳性，阳性率为40%，而在25例侵出肌层的标本中，有21例CK20表达阳性，阳性率为84%，χ2=6.776，p＜0.01。3 以55岁(中位数年龄)为界，将35例患者分为两组，在16例＜55岁的患者中，腹腔灌洗液中CK20mRNA表达阳性的有12例（75%），而在19例≥55岁的患者中，腹腔灌洗液中CK20mRNA表达阳性的有13例（68.4%），经统计学分析，χ2=0.184，p＞0.05，在35例直肠癌患者中，腺癌、黏液腺癌和未分化癌患者分别为26例、5例和4例，在腺癌中腹腔灌洗液中CK20表达阳性的有18例（69.2%），在黏液腺癌中有3例表达阳性（60%），在未分化癌中4例均表达阳性（100%），经fisher’s确切概率法分析，χ2=0.239，p＞0.05。4 分别采用常规病理和RT-PCR方法对35例低位直肠癌患者的各站区域淋巴结CK20的表达情况进行检测，用常规病理方法检出肠旁、系膜中和系膜根淋巴结阳性数分别为28枚（23.7%）、11枚（15.7%）、7枚（8.9%），而RT-PCR方法检出阳性例数分别为72枚（61.0%）、39枚（55.7%）、32枚（41.0%）；经统计学分析，RT-PCR方法检测各站淋巴结的阳性率均高于常规病理方法，χ2值分别为33.595， 24.391， 21.368，p值均小于0.01。5 35例低位直肠癌患者，肿瘤周径＜1/2的9例标本中，用RT-PCR方法检测区域淋巴结中CK20mRNA，其中33枚阳性，阳性率为53.2%，而在肿瘤周径≥1/2的26例标本中，有126枚为阳性，阳性率为58.9%，经统计学分析，χ2=0.629，p＞0.05。另外，在9例未侵出肌层的标本中，RT-PCR检出有44<WP=6>枚区域淋巴结CK20表达阳性，阳性率为55%，而在26例侵出肌层的标本中，有104枚CK20表达阳性，阳性率为55.9%，经统计学分析，χ2=0.019，p＞0.05。6 以55岁为界，将35例患者分为两组，在5例55岁以下的患者中，区域淋巴结中CK20mRNA表达阳性的有5例（100%），而在30例55岁以上患者中，区域淋巴结中CK20mRNA表达阳性的有26例（86.7%），经统计学分析，χ2=0.753，p＞0.05。在35例低位直肠癌患者中，在腺癌中区域淋巴结CK20表达阳性的有99枚（53.5%），在黏液腺癌中有24枚表达阳性（53.3%），在未分化癌中20枚表达阳性（55.6%），经fisher’s确?