每年全世界有180万人被诊断为肺癌,160万人因这种疾病死亡[1]。在中国,尽管肺癌的5年生存率有所上升,但仍然不足20%[2-4]。虽然近年来肺癌的早期诊断率有所增高,但仍有相当大部分肺癌患者发现时已是晚期,因此必须要探索新的治疗方案。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)广泛存在于已分化组织中,是中胚层发育的早期未分化细胞,具有多项分化潜能和较强的增殖能力。在炎症过程中,受损的器官组织可以分泌相关趋化因子促进MSCs向损伤部位迁移,并诱导其分化参与组织修复。肿瘤组织代谢比较旺盛,局部也发生炎症反应,其炎症过程和组织损伤导致的炎症相似。肿瘤和其所处的微环境中的多种生长因子、炎性细胞因子、趋化因子等可诱导MSCs归巢[5,6]。最初,人们认为MSCs发挥其作用是通过局部植入和分化成各种细胞类型的能力,随后替代受损组织。然而近年来研究结果提示大多数植入的MSCs无法在受损的组织中存活,MSCs治疗机制可能归因于其分泌的大量生物活性分子,[7]。由于其迁移能力和归巢肿瘤的特点,MSCs已经被设计为肿瘤细胞的特异性靶向提供抗癌剂,从而提供了一种新的细胞介导基因治疗选择[8]。目前,在包括肺癌的不同肿瘤中观察到了抗肿瘤能力[9-13],MSCs已成为癌症治疗的潜在工具。然而相关研究也发现MSCs与癌症进展有关,因而MSCs对肿瘤的发生发展作用一直存在争论。有研究显示迁移至肿瘤内的MSCs能够促进肿瘤的生长和迁移[14,15];人骨髓来源MSCs能够促进胰腺癌细胞的生长[16],人脂肪干细胞可以通过分泌蛋白诱导乳腺癌细胞的转移[17].还有研究提示同一来源的MSCs对不同的肿瘤其作用不同,比如人脂肪来源的MSCs可抑制A549细胞移植瘤生长,却能促进结直肠癌HT-29细胞移植瘤的生长[18]。以上研究结果说明MSCs对肿瘤增殖作用不仅与其来源有关,还与肿瘤的类型有关。李林等[19]研究发现骨髓来源的MSCs在体外抑制A549细胞增殖,在体内则促进A549移植瘤生长。此研究表明了同一来源的MSCs在不同的环境下对同一种肿瘤细胞的作用也可能有所不同。因此探讨MSCs在不同环境下对肿瘤不同作用的机制,从而将MSCs更安全的用于肿瘤治疗具有十分重要的意义。细胞对缺氧或低氧水平的反应是由被称为缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)的转录因子驱动的进化保守程序。肿瘤细胞在缺氧状态下可通过缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor,HIF-1α)激活促进糖原代谢的酶或血管生成而促进肿瘤增殖[20]。缺氧是实体瘤的一个重要特点,但常规体外培养肿瘤细胞不能体现出体内实体肿瘤缺氧微环境状态。因此,我们推测,MSCs在体内外对肺腺癌A549细胞增殖的作用相反,与体内外的缺氧微环境差异有关。胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)的结构与胰岛素类似,因而得名。IGF-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)是多功能细胞增殖调控因子,动物体内几乎所有器官的生长和功能都与它有关。IGF-1可促进机体的蛋白质和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代谢,在受体和结合蛋白的介导下,通过多种方式(包括自分泌、旁分泌和内分泌等)作用于靶器官,促进细胞的生长和分化。在肿瘤细胞的增殖过程中,肿瘤细胞能够合成IGF-1,通过IGF-1/IGF-1R回路刺激自我增殖[21];在肿瘤的浸润和转移过程中中,IGF-1/IGF-1R能上调血管内皮生长因子表达增加[22]。研究表明,肺癌细胞HIF-1α的表达调控因素不仅是缺氧,还包含其他非缺氧因素,例如肿瘤抑制基因p53,pVHL和PTEN,病毒癌基因如EBV和HPV-16,IGF-1[23-25]等。因此,作为HIF-1α上游调控信号的IGF-1,在缺氧条件下MSCs促进A549细胞增殖过程中可能也发挥了调控作用。miRNA是一类由21～25个核苷酸构成的非编码RNA,其功能是在转录水平上抑制基因表达,由约70核苷酸大小的可形成发夹结构的前体加工而来,一般来源于细胞染色体的非编码区域。研究表明miRNA具有表达的特异性,能够区分组织来源,其表达或结构异常与肿瘤发生密切相关,涉及肿瘤的增殖、浸润、转移、分期及预后等[26,27[。因此miRNA在肿瘤组织中的异常表达具有辅助诊断及开发靶向治疗药物的潜力。本实验通过建立体外hUCMSCs与A549细胞非接触共培养模型及A549细胞移植瘤模型,探讨缺氧条件下HIF-1α和IGF-1在hUCMSCs对A549细胞增殖的影响及分子机制。同时应用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片检测hUCMSCs对A549细胞miRNA表达谱的影响,然后应用生物信息学分析差异表达的miRNA生物学功能及其与IGF-1和HIF-1α的关系,为进一步探索hUCMSCs促进A549细胞增殖的机制及寻找有效的靶基因治疗肺癌提供前期理论基础。第一部分 缺氧条件下HIF-1α在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制[目的]观察缺氧条件下及体内hUCMSCs对A549细胞增殖的影响,并探讨缺氧条件下HIF-1α在hUCMSCs促进A549细胞增殖中的机制。[方法]1.建立A549细胞和hUCMSCs的非接触共培养模型。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,采用MTT实验、细胞划痕试验和流式细胞术分别检测缺氧条件下hUCMSCs对A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。qPCR和western blot检测 A549 细胞 HIF-1α、survivin、Bcl-2、Caspase3、JAK1、JAK2 和 STAT3基因及蛋白表达情况。2.建立hUCMSCs与A549细胞共注射移植瘤模型。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,观察hUCMSCs对A549细胞移植瘤生长的影响,并检测HIF-1α、survivin、Bcl-2、Caspase3、JAK1、JAK2、STAT3 基因及蛋白表达水平。[结果]1.在培养72h后,常氧培养条件下hUCMSCs抑制A549细胞增殖(P<0.01)和迁移(P<0.05)。与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞增殖能力及迁移能力均增强(P均<0.01),与hUCMSCs共培养进一步增强其增殖能力和迁移能力(P均<0.01)。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,缺氧条件下A549细胞增殖的能力和迁移能力明显下降(P均<0.01),与hUCMSCs共培养后A549细胞增殖能力和迁移能力并未恢复(P>均0.05)。2.在培养72h后,常氧培养条件下与hUCMSC共培养组A549细胞凋亡率较单独A549细胞培养组上升(P<0.01);与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞凋亡率下降(P<0.01)。与hUCMSCs共培养后,A549细胞的凋亡水平进一步下降;干扰A549细胞HIF-1α表达后,A549细胞凋亡率明显增加(P<0.01);,与hUCMSCs共培养后A549细胞凋亡率无明显变化(^>0.05)。3.与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白表达水平均增高(P<0.01),Caspase3基因及蛋白水平下调(P<0.01)。与hUCMSCs共培养进一步促进A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白表达水平上调及Caspase3基因及蛋白表达水平下调。缺氧条件下干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3 基因及蛋白水平均下调(P<0.01),Caspase3基因及蛋白水平均上调(P<0.01),与hUCMSCs共培养后对A549细胞内这些基因及蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05)。4.在体内,hUCMSCs促进A549细胞移植瘤的增长,HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白水平均增高(P<0.01),Caspase3基因及蛋白水平下调(P均<0.01)。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,A549细胞移植瘤生长受到抑制,移植瘤组织中HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白水平均下降(P<0.01),Caspase3基因及蛋白水平上调(P<0.01),并且hUCMSCs不能恢复A549细胞移植瘤的生长能力及上述基因的表达水平。[结论]1.体外常氧培养条件下,hUCMSCs抑制A549细胞增殖和迁移,而体外缺氧条件下或在体内,hUCMSCs均促进A549细胞增殖。2.缺氧条件下或在体内,hUCMSCs通过上调A549细胞HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK、STAT3基因及蛋白水平表达上调,下调Caspase3基因及蛋白表达,从而促进A549细胞增殖和迁移,抑制凋亡。其中HIF-1α表达上调起到了重要作用。第二部分缺氧条件下IGF-1在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制[目的]探讨IGF-1在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用机制及缺氧条件下 hUCMSCs 对 A549 细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影响。[方法]1.建立hUCMSCs与A549细胞非接触共培养模型和裸鼠A549细胞移植瘤模型,qPCR及westem blot检测缺氧条件下A549细胞及体内A549细胞移植瘤中IGF-1表达水平。2.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,检测缺氧条件下hUCMSCs对A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。3.qRT-PCR及western blot检测A549细胞及移植瘤IGF-1、Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK/STAT3、Caspase3基因及蛋白的表达水平。4.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,观察A549细胞移植瘤生长情况,并检测移植瘤中上皮间充质转化相关基因E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist表达水平。[结果]1.体外常氧条件下,相比单独A549细胞培养组,与hUCMSCs共培养组A549细胞内IGF-1表达下调;,而在缺氧条件下,与hUCMSCs共培养组A549细胞内IGF-1表达上调。2.体外缺氧条件下,干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞增殖能力及迁移能力均下降(P均<0.01),Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3表达水平均下调(P均<0.01),Caspase 3表达水平上调(P<0.01)。干扰A549细胞IGF-1基因表达后,缺氧条件下与hUCMSCs共培养组A549细胞Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、STAT3 和 Caspase3 表达水平有一定程度恢复。3.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,缺氧条件下A549细胞凋亡率明显上升(P<0.01);与hUCMSCs共培养后其凋亡率无明显变化(P>0.05)。4.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞移植瘤的生长受到抑制,肿瘤组织中 Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3 表达水平均下调(P<0.01),Caspase3表达水平上调(P均<0.01)。干扰A549细胞IGF-1表达后,hUCMSCs能部分恢复 Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3 和 Caspase3 表达水平。5.缺氧条件下或在体内,hUCMSCs促使A549细胞EMT相关基因β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist 表达增加(P<0.01),E-cadherin 表达降低(在体内蛋白水平,P<0.05;余P均<0.01;)。干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞移植瘤β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist 表达下调(P<0.01),E-cadherin表达上调(P<0.01)。[结论]1.体外缺氧条件下或在体内,hUCMSCs通过促进A549细胞内IGF-1表达,上调HIF-1α表达,促进A549细胞增殖。2.体内hUCMSCs诱导A549细胞发生EMT,其机制与IGF-1表达上调有关。第三部分在体内hUCMSCs对肺腺癌A549细胞microRNA表达谱的影响及生物信息学分析[目的]探讨体内hUMSsC对A549细胞miRNA表达谱的影响,通过生物信息学分析其表达特征。[方法]1.采用Exiqon miRNA芯片检测3对hUCMSCs+A549共注射组移植瘤中A549细胞及其配对A549细胞移植瘤中miRNA差异表达情况,按照表达差异倍数和差异表达显著性(P≤0.01)分别选取前10个上调和下调差异表达的miRNA应用qPCR技术验证。2.利用DAVID数据库提供的基因功能注释工具(GO及KEGG pathways富集分析)对差异表达上调和下调的miRNA进行基因功能和调控通路分析。统计分析HMDD中与肺癌相关的miRNA与mirDB中与IGF-1或HIF-1α基因相关的miRNA,然后再和芯片结果去交集分析,找出与IGF-1或HIF-1α及肺癌相关的miRNA。[结果]1.hUCMSCs共注射组移植瘤A549细胞较单独注射组A549细胞间出现不同程度差异表达的miRNA有337个,其中表达上调的基因数目为154个,显著上调的miRNA数量为63个(差异倍数>2,P<0.05);下调的基因数目为183个,其中显著下调的基因数量为108个(差异倍数>2,P<0.05)。2.qPCR验证结果显示,在表达差异前20个基因中,表达上调的有12个,下调的有7个,而表达无差异的1个,miRNA芯片检测结果与qPCR检测的结果符合率为70%。3.生物信息学分析结果表明,表达差异的miRNA异常表达可能与DNA转录、基因表达、细胞凋亡、细胞周期等调控异常有关,涉及癌症相关microRNA、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、多功能干细胞信号通路调节、ErbB信号通路等。与肺癌相关的miRNA为6个,与HIF-1α相关的miRNA有9个,与IGF-1相关的miRNA有19个,其中与肺癌和IGF-1均相关的miRNA为miR-1827。[结论]1.体内hUCMSCs使A549细胞内部分miRNA表达出现变化。2.差异表达的miRNA与A549细胞增殖、凋亡及信号通路有关,HIF-1α和IGF-1是部分miRNA潜在靶基因。全文总结我们通过构建体外非接触共培养模型,发现在常氧培养条件下hUCMSCs抑制A549细胞增殖,而在缺氧条件下hUCMSCs促进A549细胞增殖,并发现能促进A549细胞内HIF-1α表达水平增加。通过干扰A549细胞内HIF-1α基因表达后,发现缺氧条件下hUCMSCs促进A549细胞增殖能力下降,体内动物实验同样验证以上结果,因此缺氧微环境是引起hUCMSCs在体内外对A549细胞增殖作用不同的原因。另外我们发现缺氧条件下或在体内hUCMSCs促进A549细胞发生EMT。在分子机制方面,本研究证实缺氧环境下hUCMSCs促进A549细胞内HIF-1α、Bcl-2和survivin表达水平增加,Caspase3表达下降,STAT3通路激活,从而促进细胞增殖。进一步研究发现,缺氧条件下或体内hUCMSCs促进A549细胞内IGF-1表达上调,干扰A549细胞内IGF-1基因表达后,A549细胞增殖能力下降,A549细胞HIF-1α表达下调,说明IGF-1调控了 HIF-1α的表达。本研究同时发现,干扰IGF-1基因表达后,A549细胞Bcl-2和survivin表达下调,Caspase3表达上调,JAK/STAT3通路被抑制。另外,干扰IGF-1基因表达后,hUCMSCs诱导A549细胞发生EMT的作用消失。通过miRNA芯片及生物信息学分析发现,体内hUCMSCs调控了 A549细胞内部分miRNA的表达,通过生物信息学分析发现这些差异表达的miRNA与细胞增殖、凋亡及信号通路有关,HIF-1α和IGF-1可能是miRNA潜在靶基因。本研究证实了缺氧微环境是造成hUCMSCs在体内外A549细胞增殖能力差异的原因,并进一步揭示了缺氧微环境下hUCMSCs通过上调A549细胞内IGF-1表达促进A549细胞增殖并诱导EMT发生的分子机制,并发现hUCMSCs在体内调控A549细胞的部分miRNA表达发生变化,通过生物信息学分析发现与IGF-1和HIF-1α相关的表达差异的miRNA,为hUCMSCs治疗肺癌寻找新的有效的靶基因提供前期理论基础。