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微生物高温发酵能明显降低能源消耗和减少环境污染。本文对腾冲嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)进行了主要以热激蛋白基因为耐热功能元件的挖掘,以酿酒酵母中强组成型启动子(FBA1p)为调控元件,通过单功能、双功能型2种不同组装方式进行耐热元器件的设计与构建。再以载体和基因组整合两种不同策略将构建得到的耐热元器件导入酵母细胞中,以期提高酿酒酵母的耐热性。主要研究结果如下:通过梯度升温(35-45℃)和恒定高温(42℃)培养初步表征单功能工程菌的耐热性。研究发现,来源于腾冲嗜热菌的泛素和小热激蛋白基因构建的工程菌其耐热性较好,相比于对照组,工程菌的OD660值提高了30%以上,细胞存活率提高了1.5-4.0倍。利用同源重组方法构建的耐热工程菌其OD660值和细胞存活率比对照菌株分别提高了21.6%和2.1-3.0倍。生理特性研究表明,耐热性较好的工程菌相对于对照菌株有较好的细胞壁完整性、较高的海藻糖积累量、较强的抗氧化性、乙醇耐受性和能量代谢。引入不同强度的启动子进行单功能耐热工程菌的重新构建。转录水平研究表明,菌株的耐热性强弱与耐热基因转录水平的高低相关。另外,高温发酵结果显示,利用DNA assemble方法构建的双功能耐热元器件比单功能元器件能更好的提高酵母的耐热性。42℃培养条件下,双功能耐热酿酒酵母工程菌的乙醇产量比对照菌株和单功能耐热工程菌分别提高了47.8%和23.6%。为了对耐热元器件进行功能验证,我们将较好的耐热元器件导入β-香树脂醇酿酒酵母工程菌和乙醇酵母菌。其中,耐热β-香树脂醇酿酒酵母工程菌的β-香树脂醇产量提高了33.4%,酵母的最适生长温度拓宽到35℃。耐热乙醇酵母工程菌的乙醇产量相比对照菌株提高了10%以上,尤其耐热乙醇酵母工程菌T.te-Ibp A,其乙醇产量提高了35.6%。这项研究通过提高微生物在较高温度培养下的合成效率,大大降低了能源消耗和生产成本,同时也为其他抗逆性菌株的构建设计提供了很好的科学参考价值