研究背景:糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗,导致高血糖,容易引起的一系列并发症,例如糖尿病肾病、视网膜病变、心血管病变。其中心血管病变导致死亡占糖尿病死亡的超过半数,消耗大量的社会医疗资源,尤其在中国进入老龄化社会后,医疗支出急剧上升。虽然临床上已经有不少治疗糖尿病及其并发症的药物和手段,但是药物治疗面临诸多问题,例如药品来源匮乏、费用过高、疗效欠佳、易引发各种副作用等,因此临床上寻找糖尿病及其并发症的药物治疗,极为迫切,也成为目前研究重点之一。褪黑素为内源性分子,而且分子量极小为232.28,主要来源于松果体。褪黑素的分泌受视交叉上核所控制,白天分泌减少,晚上分泌增多。强光下分泌减少,黑暗下分泌增多。目前研究发现褪黑素不仅调节昼夜节律、改善睡眠,而且具有强烈的抗氧化应激作用,可清除自由基,消除炎症等作用。在心血管保护、肥胖、代谢综合症及糖尿病及其并发症方面发挥有益的作用。Notch信号通路作为高度保守的细胞-细胞通路,可影响着细胞生长、存活、凋亡、分化等过程。本课题组已经证实了,在糖尿病心肌缺血/再灌损伤中褪黑素可激活Notch1/Hes1通路,发挥保护效应,而在糖尿病大血管病变的损伤的研究尚未见报道。JAKs信号通路也涉及许多细胞反应:细胞生存、分化、凋亡等。本课题组已经研究了褪黑素可通过激活JAK2/STAT3信号通路抗心肌缺血/再灌损伤。在糖尿病大血管病变的损伤的研究尚未见报道。研究目的:为了明确褪黑素在糖尿病大血管损伤中的保护机制,本研究通过动物试验和细胞实验进行探讨:1)探讨褪黑素可否抗糖尿病引起的血管平滑肌损伤。2)探究褪黑素是否能激活Notch1/Hes1及JAK2/STAT3信号通路抗糖尿病血管平滑肌损伤。3)探究在褪黑素抗糖尿病血管平滑肌损伤中,Notch1/Hes1与JAK2/STAT3信号通路之间的调控关系。方法:1)高脂饮食结合STZ腹腔注射诱导建立糖尿病动物模型。2)高脂高糖处理平滑肌细胞建立离体糖尿病模型。3)定期血糖仪检测大鼠血糖变化。4)EIISA法检测褪黑素、糖化血红蛋白、血脂变化。5)动脉组织超氧化物生成量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)测定。6)动脉组织免疫组化检测caspase3表达。7)Westernblot检测促凋亡或抑制凋亡标志蛋白,Notch1/Hes1及JAK2/STAT3通路蛋白表达。8)检测细胞活力(MTT法)。9)TUNEL法检测细胞凋亡。研究结果:1)在糖尿病动物实验中,褪黑素明显改善糖尿病大鼠血糖,减轻体重,降低糖化血红蛋白、降低血脂,从而减轻糖尿病损伤。2)在糖尿病动物实验中,检测胸主动脉组织的超氧化物生成量、丙二醛(MDA)水平、gp91phox蛋白表达量及超氧化物歧化酶(SOD)含量,发现褪黑素处理组(DM+Mel)较糖尿病组(DM),明显改善,证实了褪黑素在糖尿病大血管损伤中,发挥显著抗氧化应激作用。3)在糖尿病动物实验中,与糖尿病组(DM)相比,褪黑素处理组(DM+Mel)中Notch1、Hes1、JAK2及STAT3蛋白表达明显升高。另外,与(DM+Mel)褪黑素处理组相比,糖尿病组(DM)促凋亡蛋白caspase3及Bcl2表达过多,抗凋亡蛋白Bax表达减少。胸主动脉组织的免疫组化结果为糖尿病组(DM)caspase3蛋白阳性明显。因此我们怀疑褪黑素可激活Notch1/Hes1和JAK2/STAT3信号通路,发挥抗凋亡作用。4)为了进一步印证在动物实验的假设,我们采用组织贴壁法培养原代平滑肌细胞。血管组织块贴壁培养瓶中7天后,看见组织块周围呈放射状爬行平滑肌细胞。30天后大量平滑肌细胞铺满培养瓶,重叠排列或者放射排列,呈“蜂窝”状。单个细胞呈长梭形,两端细长。5)在高脂高糖环境中,予50mmol/L、100mmol/L及200mmol/L褪黑素处理,细胞活力呈一定梯度上升。并且随着褪黑素浓度升高,细胞凋亡率明显减低。此外,与HG/HF组相比,褪黑素处理组(HG/HF+Mel)gp91phox蛋白表达量显著下降(P<0.01)。此外,超氧化物歧化酶结果趋势相同。上述结果均说明在高脂高糖损伤过程中,褪黑素对平滑肌起保护及抗氧化应激损伤。6)为明确在细胞水平层面,高脂高糖环境中褪黑素对Notch1/Hes1及JAK2/STAT3信号的影响,因此检测Notch1、Hes1、JAK2和STAT3蛋白表达。与HG/HF组相比,褪黑素处理组(HG/HF+Mel)Notch1、Hes1、JAK2和STAT3蛋白表达均显著增加(P<0.01)。为探究在高脂高糖条件下,褪黑素对平滑肌细胞凋亡的影响,我们检测发现较褪黑素处理组,HG/HF组显著地升高了促凋亡蛋白Caspase3和Bax水平,降低抗凋亡蛋白Bcl2(P<0.01)水平。我们发现在在细胞水平层面,高脂高糖环境中,褪黑素对Notch1/Hes1及JAK2/STAT3信号通路、凋亡通路作用与动物实验结果是一致的。7)褪黑素通过激活Notch1/Hes1及JAK2/Stat3信号抗高脂高糖损伤。细胞实验结果,与HG/HF相比较,予DAPT或AG490组差异无统计意义(P>0.05),但较褪黑素处理组(HG/HF+Mel)相比,可见凋亡明显增加。检测超氧化物、gp91phox、Notch1/Hes1及JAK2/Stat3信号通路蛋白表达量。我们发现褪黑素处理组(HG/HF+Mel)与HG/HF组、HG/HF+Mel+DAPT组及HG/HF+Mel+AG490组相比,超氧化物及gp91phox明显减低。予DAPT组与褪黑素组相比,Notch1、Hes1、JAK2及STAT3蛋白表达显著降低(P<0.01),然而与AG490组相比较,Notch1及Hes1蛋白表达明显下降(P<0.01),但JAK2及STAT3蛋白表达未见差异(P>0.05)。褪黑素处理组与HG/HF组、HG/HF+Mel+DAPT组及HG/HF+Mel+AG490组相比,促凋亡蛋白caspase3及Bax均下降,抗凋亡蛋白Bcl2均上调。上述结果均提示,在高脂高糖环境下,明确了褪黑素通过Notch1/Hes1与JAK2/STAT3信号通路发挥抗氧化应激与抗凋亡作用,而且Notch1/Hes1与JAK2/STAT3信号通路互为上下游关系。研究结论:1)本研究证实了褪黑素对糖尿病引起的血管平滑肌损伤具有明确保护作用。2)证实了褪黑素可通过激活Notch1/Hes1与JAK2/STAT3信号通路,减轻氧化应激损伤,抵抗糖尿病引起的血管平滑肌损伤。3)我们的研究发现了褪黑素在糖尿病心血管保护作用的新机制,为糖尿病心血管保护提供新策略。