论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原体,能引起母猪繁殖障碍及各年龄段猪严重的呼吸道症状。PRRSV是有囊膜的、单股正链RNA病毒,属于尼多病毒目动脉炎病毒科,直径大约50~65 nm,表面相对平滑,病毒粒子形态多样,以球形为主。PRRSV作为一种囊膜病毒,在宿主外的生存受温度、pH、光照和培养基的影响。PRRSV热稳定性较差,其感染力随温度增加而降低;p H6.5~7.5时保持稳定,在其他条件下病毒的感染能力下降,因此,PRRSV的纯化工作难度较大,需要严格控制温度、pH值等因素。目前一般采用超速离心沉淀法和蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV,但这些方法操作繁琐、费时,难以大规模纯化病毒,并且对仪器设备的要求较高。此外,对于有囊膜结构的病毒来说,超速离心沉淀病毒和蔗糖的高黏稠和高渗透性会对病毒颗粒造成损伤,导致病毒感染能力下降及囊膜蛋白的丢失。为了克服以上缺点,本实验建立了一种温和纯化PRRSV方法,即采用差速离心、膜包超滤浓缩和Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶层析相结合的策略纯化PRRSV。通过SDS-PAGE,Western-blot和检测蛋白含量、病毒含量等方法分析纯化效果,结果表明4FF纯化后的病毒TCID50提高了50倍,病毒原液杂蛋白的去除比率为99.68%,SDS-PAGE结果图显示未见明显杂蛋白条带;将纯化好的病毒与等体积的弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C雌性小鼠,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测其免疫效果,IPMA结果表明4FF纯化病毒的免疫原性较好,特异性较强,消除了免疫后小鼠血清与Marc-145细胞蛋白的非特异性反应。按照常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,融合前加强免疫一次,取其脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,分别在CRL-2843-CD163细胞系和Marc145细胞系上采用IPMA试验筛选,共筛选到阳性克隆孔15株,挑选其中的5株阳性孔进行亚克隆化,获得5株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为1D1,9D4,6E7,7G8,7F12,其腹水IPMA效价均在1:106以上。用大肠杆菌表达的重组PRRSV N蛋白包被ELISA板,以抗PRRSV阳性克隆细胞上清为一抗作间接ELISA,检测抗PRRSV N蛋白单抗;用蛋白质印迹(Western-blotting)试验进一步验证,间接ELISA和Western-blotting结果表明1D1,9D4,7G8三株是针对PRRSV核衣壳N蛋白的特异性单抗,而6E7,7F12是针对PRRSV其它结构蛋白表位。本实验的意义:一是建立了一种温和纯化PRRSV的方法,为规模化纯化PRRSV疫苗的工艺开发奠定基础;二是建立了在不同细胞系上采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选出多株抗PRRSV单克隆抗体为研究PRRSV的抗体依赖增强作用(ADE),入侵机制,免疫机理等提供实验材料;三是成功表达了PRRSV重组N蛋白并筛选出抗PRRSV N蛋白单抗,为研制检测PRRSV抗原、抗体诊断试剂盒、胶体金快速检测试纸条和胶体碳试纸条奠定基础。