骨质疏松症(osteoporosis)是一种常见的骨代谢性疾病,具有骨量减少、骨力学强度减弱和骨折发生率高等特点。骨吸收增强或骨合成减少导致的骨重构(bone remodeling)失衡是其主要发病原因。病理表现为骨皮质变薄、骨小梁减少、变形、变细及排列紊乱,骨骼质地疏松脆弱。据统计,在1980-2008年间,全国不同地域骨质疏松发病率为6.6%-19.3%。我国骨质疏松人口基数大,增长趋势明显。按照人口发展趋势,预测到2020年我国骨质疏松发病人数将超过1.5亿,这将给社会带来巨大的经济负担。流行病学调查表明,孕期地塞米松暴露、吸烟、营养限制均可引起子代骨量降低,此外,低出生体重与成年后骨量丢失及骨质疏松发病直接相关。提示,骨质疏松具有胎儿起源。孕期多种不良环境(如外源物、饮酒、药物等)可导致胎儿低出生体重和器官发育不良。实验室前期结果证实孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure, PCE)可引起胎儿母源性糖皮质激素过暴露,导致胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)。而且胎鼠长骨发育异常,表现为体长及长骨短小、初级骨化中心发育延迟。那么,孕期咖啡因所致的母源性高GC暴露引起胎骨组织宫内发育不良的宫内编程机制如何?宫内发育不良的表现能否延续到出生后并最终引起骨质疏松症的发生?2014年Nat Rev Endocrinol系列报道指出,母源性高GC过暴露可能是介导宫内编程的关键因素。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)是人体内重要的体液调节系统。越来越多的证据表明,RAS参与了骨质发育的调控过程,RAS持续激活可导致成骨分化减少及骨质疏松发生。提示,宫内母源性GC过暴露可能通过慢性激活RAS,引起成骨分化抑制,此宫内编程改变可延续至成年,导致骨质疏松易感。为此,本课题将建立孕期咖啡因暴露所致大鼠IUGR及其成年去势刺激前后模型,系统研究IUGR胎儿在宫内及成年去势处理前后骨发育、RAS及其成骨分化能力的变化；进一步从细胞实验角度,探讨在BMSCs模型上高GC与RAS及成骨分化能力之间的关系,以阐明咖啡因引起胎儿RAS功能发育变化的发生机制,解析骨质疏松症的胎儿发育起源,充分认识成年骨质疏松症新的危险因素,指导优生优育。第一部分孕期咖啡因暴露所致的IUGR子代成年骨质疏松症易感现象及机制目的：通过整体动物实验,证实孕期咖啡因暴露可致IUGR胎鼠成年后骨RAS激活和骨质疏松症易感。方法：建立孕中晚期咖啡因(120mg/kg-d)暴露所致大鼠IUGR模型。仔鼠分为四组,正常对照组,咖啡因组,去势对照组,咖啡因+去势组(咖啡因去势组)。去势组仔鼠出生后5.5月(PM5.5)给予摘除双侧卵巢处理,所有大鼠7月处死,正常对照组及咖啡因组取膝关节下胫骨松质骨,部分用于检测血管紧张素Ⅱ含量,部分用于提取骨RNA,实时实时定量PCR技术,检测胫骨松质骨RAS (ACE、AT1R和AT2R)的nRNA表达。去势对照组及去势咖啡因组取股骨全长,MicroCT检测骨强度变化、骨相对体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(TB.N)、骨小梁孔隙(TB.SP)、骨小梁厚度(TB.TH)、骨连接密度(Conn.D.)和骨小梁连接度(SWI)。取膝关节下胫骨松质骨部分提取骨RNA,采用实时实时定量PCR技术,检测胫骨松质骨RAS (ACE、AT1R和AT2R)的mRNA表达。结果：孕期咖啡因(120mg/kg-d)暴露成年雌性大鼠基础状态下血管紧张素Ⅱ含量显著升高(P<0.05),骨ACE表达上调(P<0.05)。与去势对照组相比,孕期咖啡因(120mg/kg-d)暴露雌性成年大鼠在去势模型诱导下骨强度降低,骨三维扫描显示骨质疏松程度加重,主要指标表现为BV/TV值、TB.N数量减小,而TB.SP增大(P<0.05), TB.Th、Conn.D、SWI值未发生明显变化,胫骨松质骨ACE的nRNA表达增加(P<0.05)。结论：孕中晚期咖啡因(120mg/kg·d)暴露所致的IUGR仔鼠成年去势处理前后骨RAS均处于活化状态,骨质疏松易感性增加。第二部分 孕期咖啡因暴露所致胎鼠长骨发育迟缓及其宫内编程机制目的：在咖啡因所致的IUGR胎鼠模型上,研究母源性GC过暴露对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响及骨组织局部RAS的影响,证实胎骨存在初级骨化中心发育延迟及长骨发育不良的现象及细胞机制。方法：Wistar大鼠适应性喂养一周后,每晚6时按雌：雄=2：1合笼,次晨观察雌鼠阴栓或阴道涂片镜检,查到阴栓或精子之日为受孕0 d。受孕大鼠随机分为两组：孕期正常对照组和孕期咖啡因处理组,每组12只。孕期咖啡因处理组于孕11d起,以120mg/kg-d咖啡因灌胃,每日一次,连续给药至出生前一天(GD20),异氟烷麻醉状态下处死母鼠,选取部分IUGR雌性胎鼠,将骨化中心部分于液氮中速冻后转移至-80摄氏度冻存,用于Elisa方法检测血管紧张素Ⅱ的含量；部分长骨置于4%多聚甲醛中固定,用于制作病理切片；部分长骨骨化中心部分置于1mlTRIZOL中于-80摄氏度冻存,用于提取总RNA; HE染色和Von kossa染色技术,检测出生前胎鼠(GD20)初级骨化中心相对长度；实时实时定量PCR技术,检测胎骨初级骨化中心RAS (ACE、AT1R和AT2R)和成骨分化(Runx2、BGLAP、BSP、ALP)相关指标的mRNA表达；其余正常组雌性胎鼠和咖啡因组IUGR雌性胎鼠,至出生后两周(PW2)处死仔鼠,取长骨制作病理切片,检测PW2幼鼠次级骨化中心发育状态,提取原代BMSCs用于细胞培养,观察在成骨分化模型下成骨分化基因的表达变化。结果：在咖啡因(120mg/kg-d)处理组,胎鼠初级骨化中心相对长度明显缩短(P<0.05)；血管紧张素Ⅱ含量明显增高(P<0.05)：胎骨初级骨化中心ACE表达明显增高,AT1R/AT2R表达比显著上调(P<0.01),成骨分化相关基因(Runx2、BGLAP、>ALP)表达下调(P<0.05)；和正常对照组相比,咖啡因组出生后两周幼鼠次级骨化中心发育不良(P<0.05),在成骨分化的细胞培养模型中,咖啡因组BMSCs的成骨分化基因表达下调(P<0.01,P<0.05)。结论：孕期咖啡因暴露能通过“母源性GC过暴露”诱导骨RAS活化,使胎骨成骨分化能力降低,初级骨化中心发育迟缓,表现为长骨宫内发育不良。出生后次级骨化中心发育延迟,同时幼鼠BMSCs成骨分化能力降低。第三部分GR/ACE介导了高浓度GC所致的BMSCs成骨分化功能抑制目的：在细胞水平,以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为代表,通过研究不同浓度的皮质酮处理—GR表达增加—ACE表达增加—RAS活化—Runx2下调—成骨分化能力降低之间的内在联系,证实GR/ACE表达上调介导咖啡因所致胎骨GC活化和成骨分化能力降低,并通过GR抑制剂米非司酮(5 uM)和血管紧张素转换酶抑制剂依那普利(5 uM)的使用,探讨高GC引起RAS激活及成骨分化降低发生机制。方法：建立原代BMSCs体外培养系统,分别以0～250+M皮质酮,以高浓度皮质酮(500 uM)和的血管紧张素抑制剂(5uM),以及高浓度皮质酮1250和GR抑制剂米非司酮(5 uM)处理BMSCs 7天,实时定量RT-PCR技术检测BMSCs成骨分化条件下ACE、AT1R、AT2R和成骨分化相关的Runx2、 ALP、BSP以及骨钙素的mRNA表达；结果：①不同浓度皮质酮处理能显著上调骨髓间充质干细胞ACE的mRNA表达(P<0.01,P<0.05),同时使AT1R/AT2R表达比的上调(P<0.01,P<0.05)并可抑制成骨分化相关基因(Runx2、BGLAP、BSP、ALP)的表达(P<0.05)。②GR抑制剂和ACEI的作用：GR抑制剂的使用可以显著降低BMSCs的GR和ACE的mRNA表达(P<0.01,P<0.05);ACEI的使用可以逆转皮质酮处理下BMSCs的ACE的mRNA表达的升高(P<0.01,P<0.05),且能逆转皮质酮对成骨分化相关基因的Runx2、ALP、 BSP以及骨钙素mRNA表达的下调作用(P<0.01,P<0.05)。结论：高GC环境(皮质酮)可能通过增加激活BMSCs的GR表达,引起ACE的增加,这种作用可以导致成骨分化相关基因Runx2、ALP、BSP以及骨钙素的表达降低。咖啡因暴露所致高GC环境对胎骨的RAS的激活可能胎儿宫内长骨发育不良的原因,也是最终引起IUGR及其成年骨质疏松易感的宫内发生起源。