【摘 要】
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该文着重进行了MT-1基因的克隆.目的基因MT-I已由本组林琳教师成功地克隆了,即从经济ZnSO诱导的Balb/C小鼠的肝脏细胞中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增MT-I基因,全长为186bp,
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该文着重进行了MT-1基因的克隆.目的基因MT-I已由本组林琳教师成功地克隆了,即从经济ZnSO<,4>诱导的Balb/C小鼠的肝脏细胞中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增MT-I基因,全长为186bp,克隆到pUC19上,转化大肠杆菌DH<,5α>,经PCR筛选和限制性内切酶鉴定,得到阳性菌株,测序与已报道的小鼠MT-IcDNA的基因序列一致.该文在此基础之上,用基因工程的方法,获得一套稳定的天然状态的(而非融合的)金属硫蛋白-I的大肠菌表达系统,为此作了以下的工作:1、设计合成一对特异引物,分别带有NDEI和ECORI的限制性内切酶的识别位点,用PCR方法扩增MT-ICDNA的基因片段.这样MT-I基因的两侧就带有了NDEI和ECORI的识别位点.2、用限制性内切酶NDEI和ECORI酶切MT-ICDNA的PCR产物,将其插入到质粒表达载体pET21a中相应的限制性酶切位点,构建非融合质粒表达载体pET21a-MT.3、将重组质粒pET21a-MT转化入克隆菌ECOLIDH<,5α>中,经PCR鉴定菌株.4、以双脱氧末端终止法对克隆的MT-I基因进行测序,结果表明与已报道的小鼠MT-I基因序列一致.5、通过电穿孔的方法将测序正确的阳性重组质粒pET21a-MT诱入大肠杆菌表达菌BL<,21>(DE<,3>)中.6、用PCR方法再次对转化菌筛选、鉴定、确认pET21a-MT已经成功地转化到了BL<,21>(DE<,3>)中.该文成功地构建了MT-I基因的原核表达载体pET21a-MT.
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